【正文】 34微生物實驗室操作指導書（受控）微生物實驗室操作指導書目錄（一）安全守則（二）檢驗總則（三）基本技術(shù)要求（四）食品平板菌落計數(shù)（五）食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法（六）沙門氏菌檢驗（七）金黃色葡萄球菌檢驗（八）霉菌計數(shù)（九）革蘭氏染色（十）空氣中微生物的檢驗（十一） 水中微生物的檢驗（十二）食品接觸面的微生物檢驗（十三）蔬菜農(nóng)殘的快速檢測審核：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　編制： （一）安全守則1 進入實驗室工作衣、帽、鞋必須穿戴整齊。2 在進行高壓、干燥、消毒等工作時，工作人員不得擅自離開現(xiàn)場，認真觀察溫度、時間，蒸餾易揮發(fā)、易燃液體時，不準直接加熱，應(yīng)置水浴鍋上進行。3 嚴禁用口直接吸取藥品和菌液，按無菌操作進行，如發(fā)生菌液、病原體濺出容器外時，應(yīng)立即用有效消毒劑進行徹底消毒，安全處理后方能離開現(xiàn)場。4 工作完畢，兩手用清水肥皂洗凈，必要時可用（殺菌劑）新潔爾滅、過氧乙酸液浸泡手，然后用水沖洗，工作服應(yīng)經(jīng)常清洗，保持整潔，必要時高壓消毒。5 實驗完畢，及時清理現(xiàn)場和實驗用具，對染菌帶毒物品，進行消毒滅菌處理，并填寫日常工作記錄。6 每日下班，認真檢查水、相關(guān)電源是否關(guān)閉和正在使用的設(shè)備運轉(zhuǎn)是否正常，并認真記錄。下班前關(guān)好門窗，方可離去。（二）檢驗總則1 主題內(nèi)容與適用范圍　本文規(guī)定了微生物檢驗一般規(guī)則。本文適用于食品中微生物學檢驗的采樣、檢驗及結(jié)果報告。2 樣品的采集 采樣目的確保采集的樣品能代表全部被檢驗的物質(zhì)，使檢驗分析更具代表性。 采樣原則 采集的樣品要有代表性，采樣時應(yīng)首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查，檢查是否有污染源存在，同時能反映全部被檢食品的組成、質(zhì)量和衛(wèi)生狀況。 應(yīng)設(shè)法保持樣品原有微生物狀況，在進行檢驗前不得污染，不發(fā)生變化。 采樣必須遵循無菌操作程，容器必須滅菌，避免環(huán)境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新潔爾滅、酒精等消毒物滅菌，更不能含有此類消毒藥物，以避免殺掉樣品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可使用。 采樣數(shù)量取樣數(shù)量的確定，應(yīng)考慮分析項目的要求、分析方法的要求及被檢物的均勻程度三個因素。樣品應(yīng)一式三份，分別供檢驗、復檢及備查使用，每份樣品數(shù)量一般不少于200g。根據(jù)不同種類采樣數(shù)量略有不同，實驗室檢驗樣品一般為25克。 采樣方法 采取隨機抽樣的方式。 直接食用的小包裝食品，盡可能取原包裝，直到檢驗前不要開封，以防污染。 如為非冷藏易腐食品，應(yīng)迅速將所采樣品冷卻至0－4℃。 不要使樣品過度潮濕，以防食品中固有的細菌增殖。 在將冷凍食品送到實驗室前，要始終保持樣品處于冷凍狀態(tài)。樣品一旦融化，不可使其再凍，保持冷卻即可。 樣品的保存和運送 樣品采集完后，應(yīng)迅速送往實驗室檢驗，送檢過程中一般不超過3h，如路程較遠，可保存在1－5℃環(huán)境中，如需冷凍者，則在冷凍狀態(tài)下送檢。 冷凍樣品應(yīng)存放在－15℃以下冰箱內(nèi)；冷卻和易腐食品應(yīng)存放在0－5℃冰箱或冷卻庫內(nèi)；其它食品可放在常溫冷暗處。 運送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。 待檢樣品存放時間一般不應(yīng)超過36小時。3 檢驗樣品的制備 樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。 檢驗冷凍樣品前應(yīng)先使其融化。可在0－4℃融化，時間不超過18小時，也可在溫度不超過45℃的環(huán)境中融化，時間不超過15分鐘。 檢驗液體或半固體樣品前應(yīng)先將其充分搖勻。如容器已裝滿，可迅速翻轉(zhuǎn)25次；如未裝滿，可于7s內(nèi)以30cm的幅度搖動25次。從混樣到檢驗間隔時間不應(yīng)超過3分鐘。 開啟樣品包裝前，先將表面擦干凈，然后用75％乙醇消毒開啟部位及其周圍。 非粘性液體樣品可用吸管吸取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)，,也不得將吸有樣品的吸管浸入稀釋液或培養(yǎng)基內(nèi)。 粘性液體樣品可用滅菌容器稱取一定量，然后加入適量的稀釋液或培養(yǎng)基。 固體或半固體樣品可用滅菌的均質(zhì)杯稱取一定量，再加適量的稀釋液或培養(yǎng)基進行均質(zhì)，從樣品的均質(zhì)到稀釋和接種，相隔時間不應(yīng)超過15分鐘。4 檢驗 實驗室收到樣品后，首先進行外觀檢驗，及時按照國家標準檢驗方法進行檢驗，檢驗過程中要認真、負責，嚴格進行無菌操作，避免環(huán)境中微生物污染。 檢驗所使用的稀釋液、試劑、培養(yǎng)基接觸的一切器皿必須經(jīng)過有效的滅菌。 實驗室所用儀器、設(shè)備的性能應(yīng)定期檢查和校正。 制備試劑和培養(yǎng)基所用的水，應(yīng)為無離子水或用玻璃器皿蒸餾的蒸餾水。 檢驗結(jié)束后，所有帶菌的培養(yǎng)基、試劑、稀釋液和器皿必須盡快滅菌和洗刷。清洗過的器皿不應(yīng)殘留洗滌劑的痕跡。5 檢驗記錄和結(jié)果的報告 經(jīng)檢驗的每份樣品都應(yīng)有完整的檢驗記錄。樣品檢驗過程中所用方法、出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果等均要用文字寫出試驗記錄，以作為對結(jié)果分析、判定的依據(jù)，記錄要求詳細、清楚、真實、客觀、不得涂改和偽造。 檢驗結(jié)束后，根據(jù)檢驗結(jié)果，及時填寫檢驗報告書，簽字并經(jīng)負責人審核簽字后發(fā)出。（三）基本技術(shù)要求1 無菌操作要求微生物實驗室工作人員，必須有嚴格的無菌觀念，許多實驗要求在無菌的條件下進行，主要原因，一是防止試驗操作中人為污染樣品，二是保證工作人員安全，防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。要求如下： 接種細菌時必須穿工作服、帶工作帽； 進行接種食品樣品時，必須穿專用的工作服、帽及拖鞋，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用； 接種食品樣品時，應(yīng)在進無菌室前用肥皂洗手，然后用酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簦? 進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應(yīng)高壓滅菌或用酒精點燃燒灼三次后使用； 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及試管或平皿邊； 接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌活樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒； 接種環(huán)和針在接種細菌前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到針和環(huán)與桿的連接處，接種結(jié)核菌和烈性菌的接種環(huán)應(yīng)在沸水中煮沸5min,再經(jīng)火焰燒灼； 吸管吸取菌液或樣品時，應(yīng)用相應(yīng)的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。2 無菌間使用要求 無菌間應(yīng)密封，不得隨意打開，并設(shè)有與無菌間大小相應(yīng)的緩沖間及門，另盡量設(shè)有的小窗，以備進入無菌間后傳遞物品。 無菌間應(yīng)保持清潔，工作后用煤酚皂液溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與試驗無關(guān)的物品。 無菌間使用前后應(yīng)將門關(guān)緊，打開紫外燈，如采用室內(nèi)懸掉紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離工作臺1m處，照射時間不少于30分鐘，使用紫外燈，應(yīng)注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精球輕輕擦拭，除去上面的灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。 處理和接種食品標本時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。 在無菌間需用安裝空調(diào)時，則應(yīng)有過濾裝置。3 消毒滅菌要求微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等，必須經(jīng)滅菌后方能使用。 滅菌前準備 所有需經(jīng)滅菌的物品首先要清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應(yīng)將上面氣孔打開。 裝培養(yǎng)基的三角瓶塞好棉塞，用紙包好，試管蓋好蓋，注射器須將管芯抽出，用紗布包好。 裝放 大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品不應(yīng)超過鍋內(nèi)容積的80%，物品應(yīng)放置鍋內(nèi)擱架上或鐵絲筐中。 手提式高壓鍋：將物品分別包扎好，直接放入消毒筒內(nèi)，物品之間不能過擠。 設(shè)備檢查 檢查門的開關(guān)是否靈活，橡皮圈有無損壞，是否平整。 壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關(guān)好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。 對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應(yīng)檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。 滅菌處理手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應(yīng)按下列步驟進行： 手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水，立式高壓鍋加水16L（重復使用時應(yīng)將水量補足，水變混濁需要更換）。 手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用）。 蓋好頂蓋擰緊，勿使漏氣；置滅菌器于火源上加熱，立式壓力鍋通上電源，并打開頂蓋上的排氣閥放出冷氣（水沸騰后排氣10～15min）。 關(guān)閉排氣閥，使蒸氣壓上升到規(guī)定要求，并維持規(guī)定時間（按滅菌物品性質(zhì)與有關(guān)情況而定）。 達到規(guī)定時間后，對需干燥的物品，立即打開排氣閥排出蒸汽，待壓力恢復到零時，自然冷卻至60℃后開蓋