【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 復(fù)染這一步，能否區(qū)別革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌？ 5.你認(rèn)為制備細(xì)菌染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)? 6.為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察? 7.如果涂片未經(jīng)熱固定，將會(huì)出現(xiàn)什么問(wèn)題?加熱溫度過(guò)高、時(shí)間太長(zhǎng)，又會(huì)怎樣呢? 實(shí)驗(yàn)三 培養(yǎng)基的制備和滅菌實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：《微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、分裝方法；。二、實(shí)驗(yàn)原理 培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營(yíng)養(yǎng)類型，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性降低。任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。三、實(shí)驗(yàn)材料 器皿及材料 天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。 藥品試劑 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO瓊脂、NaNOKCl、MgSOFeSO蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計(jì)、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。 流程 稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過(guò)濾分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1培養(yǎng)基的制備 稱量藥品 根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時(shí)要迅速。 溶解 用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。 調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。 溶化瓊脂 固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分(水需預(yù)熱)。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。 過(guò)濾分裝 分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。 包扎標(biāo)記 培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。 滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長(zhǎng)度一般以不超過(guò)試管長(zhǎng)度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。 倒平板 將需倒平板的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板。2 滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過(guò)加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因?yàn)樵跐駸崆闆r下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強(qiáng)，可增加滅菌效力。 濕熱滅菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內(nèi)加水煮沸。對(duì)于細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)體煮沸約15～30min，對(duì)于芽孢則需煮沸約1～2h。 高壓蒸汽滅菌法：高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。 操作方法和注意事項(xiàng) 加水：打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋?zhàn)詈糜靡阎箝_過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。 裝料、加蓋：滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。 排氣：打開排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。 升壓、保壓和降壓：當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開始計(jì)算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開放氣閥。注意不能過(guò)早過(guò)急地排氣，否則會(huì)由于瓶?jī)?nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶?jī)?nèi)液體沖出容器之外。 滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)：滅菌后的培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)24h培養(yǎng)無(wú)菌生長(zhǎng)，可保存?zhèn)溆茫恍泵媾囵B(yǎng)基取出后，立即擺成斜面后空白培養(yǎng)；半固體的培養(yǎng)基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養(yǎng)。 干熱滅菌法 通過(guò)使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。 滅菌前的準(zhǔn)備 玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi)；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結(jié)扎緊，以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心，輕輕捅入管口，松緊必須適中，管口外露的棉花纖維統(tǒng)一通過(guò)火焰燒去，滅菌時(shí)將吸管裝入金屬管筒內(nèi)進(jìn)行滅菌，也可用紙條斜著從吸管尖端包起，逐步向上卷，頭端的紙卷捏扁并擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。 干燥箱滅菌 將包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內(nèi)層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160～170℃并恒溫1～2h，注意勿使溫度過(guò)高，超過(guò)170℃，器皿外包裹的紙張、棉花會(huì)被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120℃持續(xù)30分鐘即可。溫度降至60～70℃時(shí)方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會(huì)因驟冷而爆裂。 用此法滅菌時(shí)，絕不能用油、蠟紙包扎物品。 火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌，迅速?gòu)氐?。?duì)于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過(guò)程中，試管或三角瓶口，也采用通過(guò)火焰而達(dá)到滅菌的目的。 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。 試述高壓蒸汽滅菌的過(guò)程及注意事項(xiàng)。 六、思考題 制備培養(yǎng)基的一般程序是什么？ 做過(guò)本次實(shí)驗(yàn)后，你認(rèn)為在制備培養(yǎng)基時(shí)要注意些什么問(wèn)題？ 滅菌在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作中有何重要意義？ 試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。 高壓蒸汽滅菌時(shí)應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？ 實(shí)驗(yàn)四 純種微生物的分離、轉(zhuǎn)種和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目性質(zhì)：基礎(chǔ)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)所屬課程名稱：《微生物學(xué)及實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)計(jì)劃學(xué)時(shí)：3學(xué)時(shí)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解微生物分離和純化的原理；掌握常用的分離純化微生物的方法；掌握菌落特征的觀察；學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)； 建立無(wú)菌操作的概念，掌握無(wú)菌操作的基本環(huán)節(jié)。二、實(shí)驗(yàn)原理 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。 土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)