【文章內(nèi)容簡介】 2. 平板劃線分離法： 將菌液分離樣品搖勻，以無菌操作用接種環(huán)直接取試管中待分離純化的菌液，將接種環(huán)通過稍打開皿蓋的縫隙（約 30℃ ）伸入平板，將菌液點種在平板邊緣一處，取出接種環(huán)，燒去多余的菌種，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環(huán)冷卻 ,然后從接種有菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時平板面與接種環(huán)面成 3040℃ ，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線 ,接種環(huán)不要嵌入培養(yǎng)基內(nèi)劃破培養(yǎng)基 ,線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊，劃線完畢，關(guān)上皿蓋 .灼燒接種環(huán)，待冷卻后放置接種架上。 平板劃線菌落分離效果圖 ,以免損壞。 ，不能用手指或粗布，以保證光潔度 ，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 ，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項 二、顯微操作 現(xiàn)場演示 ：粗調(diào)、細調(diào)。依次再進行中倍、高倍觀察 ：高倍鏡下找到清晰的物象后，提升聚光鏡，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調(diào)至看清物象為止。 ：另換新片，必須從第一條開始操作。 ：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯，后將鏡體全部復原。 注意：油鏡使用完畢后一定要用二甲苯擦拭鏡頭 五 、問題與討論 ？固定加熱時間過長會怎樣？ ，為什么必須用香柏油？ ，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？ ，為何要盡量使試管平放？ 六、實驗報告 本次實驗課結(jié)束 請確保油鏡頭擦拭干凈！ 請第一組同學留下值日 下周再見！ （一）實驗目的 學習并掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法； 初步了解放線菌帶形態(tài)特征 。 實驗五 放線菌的形態(tài)觀察 二、實驗內(nèi)容： 觀察放線菌菌落及菌絲、分生孢子形態(tài)。 三、材料： 菌種：鏈霉菌 %美藍染液、載片和蓋片。 四、實驗步驟 菌落形態(tài)及菌苔特征： 以無菌操作分別取鏈霉菌制成菌懸液在平板培養(yǎng)基上用劃線法接種， 2528℃ 培育 57天，觀察菌落的表面形狀、大小、顏色和邊緣等；并注意放線菌在基質(zhì)上著生緊密情況。 區(qū)別基內(nèi)菌絲，氣生菌絲及孢子絲的著生部位，取斜面培養(yǎng)鏈霉菌觀察菌苔特征，注意孢子顏色，營養(yǎng)菌絲顏色和色素分泌情況等。 A：卡特利鏈霉菌； B：弗氏鏈霉菌； C：吸水鏈霉菌金淚亞種；D：卡那霉素鏈霉菌； E：除蟲鏈霉菌； F：生磺酸鏈霉菌 個體形態(tài)特征的觀察 取一個平板，選擇菌絲和孢子生長較薄的部位，直接置于低倍鏡和高倍鏡下觀察。或用接種鏟連同菌苔一薄層培養(yǎng)基取下一小塊，平置于載玻片上進行觀察，注意放線菌菌絲直徑大小，孢子絲的形狀。 鏈霉菌形態(tài)觀察 放線菌的孢子絲描繪圖 ?插片法 將放線菌接種在瓊脂平板上 ， 插上滅菌蓋玻片后培養(yǎng) ， 使放線菌絲沿著培養(yǎng)基表面與蓋玻片的交接處生長而附著在蓋玻上 ， 觀察時 ，輕輕取出蓋玻片 ， 置于載玻片上直接鏡檢 。 這種方法可以觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征 ， 而且便于不同生長期的形態(tài) 。 ?印片法 將要觀察帶放線菌帶菌落或菌苔 ， 先印在載玻片上 ， 經(jīng)染色后觀察 。 這種方法主要用于觀察孢子絲帶形態(tài) 、 孢子帶排列及其形狀等 。 該方法簡便 、 但形態(tài)特征可能有所改變 。 印片法步驟： 取一蓋片，輕輕放在菌落表面按壓一下，使孢子貼附在蓋片上，然后在載片上加一小滴%美藍染液（或加一滴水），將蓋片帶有孢子的面向下，蓋在染液上，用吸水紙吸去多余的染液，在高倍鏡或油鏡下觀察孢子形狀以及斷裂方式。 印片 → 微熱固定 → %美藍染液染色 1min→ 水洗 → 晾干 → 鏡檢 ? 鏟菌苔時注意不要將瓊脂 鏟得太厚 ， 以免影響壓片； ? 玻片 不要太熱 ， 以免瓊脂融化 ， 干擾放線菌的附著； ? 制片過程中切 不可涂片 ， 以免破壞菌絲形態(tài)； ? 印片完畢后注意將印有放線菌的一面朝上進行固定 ， 印片不要用力過大 壓壞瓊脂培養(yǎng)基 ， 也不要挪動 ， 以免改變放線菌的自然形態(tài)； ? 觀察時宜 采用略暗的光線 。 注 意 事 項 四、實驗報告 繪圖觀察的放線菌形態(tài)。 五、作業(yè) 1．在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲 ? 2．用插片法和印片法如何制備放線菌標本，其主要優(yōu)點是什么 ?可否用此法觀察其他微 生物 ?為什么 ? 實驗六 細菌的革蘭氏染色 及芽孢染色 學習微生物涂片 、 染色的操作技術(shù)； 掌握細菌的革蘭氏染色的方法； 初步掌握無菌操作技術(shù)； 掌握革蘭氏染色反應原理 、 操作步驟和意義 。 一、實驗目的 二、實驗原理 革蘭氏染色法法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌 (G－ )和革蘭氏陰性菌 (G＋ )兩大類，是細菌學上是常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為 G－菌和 G＋菌，是由這兩類菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。 G－菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復合物易于滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)番紅復染后就成紅色。 G＋菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。 細菌的芽胞具有厚而致密的壁 ， 透性低 ， 不易著色 ， 若用一般染色法只能使菌體著色而芽胞不著色 (芽胞呈無色透明狀 )。 芽胞染色法就是根據(jù)芽胞既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點而設計的 。 所有的芽胞染色法都基于同一個原則：除了用著色力強的染料外 ， 還需要加熱 ， 以促進芽胞著色 。 當染芽胞時 ， 菌體也會著色 ， 然后水洗 ， 芽胞染上的顏色難以滲出 ， 而菌體會脫色 。 然后用對比度強的染料對菌體復染 ， 使菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色 ， 因而能更明顯地襯托出芽胞 ， 便于觀察 。 革蘭氏染色： （ 1） 黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 大腸桿菌（ ） 、 枯草桿菌 ， 待測菌菌液 l～ 2種； （ 2） 革蘭氏染色液 (結(jié)晶紫染液 、 盧戈氏碘液 、 95％ 乙醇 、石炭酸復紅液等 )、 （ 3） 香柏油 、 二甲苯；顯微鏡 、 擦鏡紙 、 接種環(huán) 、 載玻片 、 吸水紙 、 試管 、 小滴管 、 酒精燈 。 三、實驗材料 四、 操作步驟 （一） 革蘭氏染色法 制片 （ 1 ） 涂菌 用無菌操作方法從試管中沾取菌液一環(huán) ， 用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻 、 直徑約 1cm的菌膜 。 涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌 。 （ 2） 干燥 于空氣中自然干燥 。 亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥 (溫度不宜