【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 殺菌作用，其作用機(jī)制主要是干擾細(xì)菌的代謝，阻礙和影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、膜的通透性及核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，不同的細(xì)菌種類或菌株，對(duì)同一藥物的敏感性不同，因此測(cè)定病原菌對(duì)抗菌類藥物的敏感性，對(duì)于合理用藥和提高臨床療效具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)兩種方法測(cè)定細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感程序。 [內(nèi)容與方法]一、紙片法密集接種法接種細(xì)菌：用無(wú)菌接種環(huán)挑取已培養(yǎng)好的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物少許，先在平板瓊脂表面中央劃一條線，垂直該線作平行密集劃線，劃滿平板。再將平板轉(zhuǎn)動(dòng)90度，作平行密集劃線，劃滿平板。用無(wú)菌注射針頭挑取抗生素（青霉素、鏈霉素、紅霉素、慶大霉素、卡那霉素等）濾紙片，貼在平板瓊脂表面。濾紙片之間距離應(yīng)基本相等，一般每個(gè)平板貼四到五個(gè)濾紙片為宜。注意每次取濾紙片之前，針頭須燒灼滅菌冷卻。將平板置37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后取出觀察濾紙片周圍的抑菌圈（見(jiàn)圖20~1），用尺子測(cè)量其直徑并對(duì)照細(xì)菌對(duì)抗生素敏感度判斷表做出結(jié)果判斷。二、試管法金黃色葡萄球菌菌液制備取金黃色葡萄球菌6~，置37℃溫箱培養(yǎng)6~8小時(shí)后備用。方法（1）取10支無(wú)菌小試管標(biāo)號(hào)后，除第一管外其它每管加入肉湯培養(yǎng)基1ml。（2）在第一、二管中各加入青霉素（50u/ml）溶液1ml，混勻。（3）從第二管中吸取1ml加入第三管中，混勻，然后依此法加樣稀釋至第九管，再?gòu)牡诰殴苤谐槿?ml棄去。第十管不加青霉素作為對(duì)照管。（4），混勻。（5）置37℃溫箱培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果，以培養(yǎng)基混濁程度來(lái)判斷細(xì)菌對(duì)青霉素的敏感程度，最高稀釋度的抗菌藥物仍能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)者為最低抑菌濃度（MIC）可用單位/ml表示之。 常用藥敏試驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)與其相應(yīng)的MIC近似值抗菌藥物 紙 片 抑菌圈直徑（毫米） 最低抑菌濃度（微克/毫升） 含藥量 耐藥 中度敏感 敏感 耐藥 敏感 青霉素葡萄球菌 10單位 ≤20 2128 ≥29 ≥ ≤ 其它細(xì)菌 10單位 ≤11 1221 ≥22 ≥32 ≤ 鏈 霉 素 10 微克 ≤11 1214 ≥15 ≥15 ≤ 6氯 霉 素 30微克 ≤12 1317 ≥18 ≥25 ≤ 紅 霉 素 15 微克 ≤13 1417 ≥18 ≥8 ≤ 2 慶 大 霉 素 10微克 ≤12 1314 ≥15 ≥8 ≤ 4 卡 那 霉 素 30微克 ≤13 1417 ≥18 ≥25 ≤ 6四 環(huán) 素 30微克 ≤14 1518 ≥19 ≥12 ≤ 4多 粘 菌 素 300單位 ≤8 911 ≥12 ≥50單位 磺 胺 300 微克 ≤12 1316 ≥17 ≥350 ≤100 甲氧苯青霉素 5 微克 ≤9 1013 ≥14 ≤3 萘 啶 酸 30 微克 ≤13 1418 ≥19 ≥32 ≤12實(shí)驗(yàn)報(bào)告：記錄血漿凝固酶試驗(yàn)結(jié)果；記錄藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)合系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)病原性球菌鑒定作出結(jié)論。實(shí)驗(yàn)八 腸道桿菌的鑒定（一） 腸道桿菌是一群寄居于人或動(dòng)物的腸道內(nèi)的細(xì)菌，多數(shù)為非致病菌或條件致病菌，少數(shù)為致病菌。其生物學(xué)性狀相似，但生化反應(yīng)、抗原構(gòu)造有差異，據(jù)此可將它們分類、鑒定。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?．熟悉腸道桿菌未知標(biāo)本分離和鑒定方法；2．掌握肥達(dá)式反應(yīng)的原理及結(jié)果分析，熟悉其操作過(guò)程；3．了解大腸桿菌、痢疾桿菌及傷寒桿菌革蘭氏染色形態(tài)示教片4．了解腸道桿菌常見(jiàn)的一些生化反應(yīng)及其在鑒定上意義、實(shí)驗(yàn)材料：1. 大腸桿菌或痢疾桿菌或傷寒桿菌革蘭氏染色形態(tài)示教片2. 大腸桿菌、痢疾桿菌（或傷寒桿菌）在SS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物（示教）；3. 大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒甲或乙等在雙糖鐵培養(yǎng)基上的 培養(yǎng)物（示教）；4. 大腸桿菌與痢疾桿菌（或傷寒桿菌）的混合菌液（模擬糞便標(biāo)本）；5. 痢疾桿菌及傷寒桿菌診斷血清，生理鹽水，玻片；6. 診斷用肥達(dá)式菌液、肥達(dá)式平板、小試管、吸管、無(wú)菌滴管、傷寒患者血清（經(jīng)56℃30分鐘滅活）、水浴箱等；7. 單糖發(fā)酵管、蛋白胨水培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、葡萄球菌和綠膿桿菌在普通瓊脂平板上的培養(yǎng)物。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 1．肥達(dá)氏反應(yīng)①原理：人體感染傷寒桿菌或副傷寒桿菌后，能產(chǎn)生與這些細(xì)菌起特異性反應(yīng)的抗體，這種抗體及其量可以用已知的抗原來(lái)測(cè)得。本實(shí)驗(yàn)用已知的傷寒桿菌H、0抗原和甲型、乙型副傷寒桿菌的H抗原與可疑病人血清做定量凝集試驗(yàn)，可測(cè)定患者血清中相應(yīng)抗體的含量及其增減情況，以協(xié)助傷寒或副傷寒病的診斷。②方法：?。┤∫挥?0（5*4）孔的有機(jī)反應(yīng)板2塊，連續(xù)標(biāo)號(hào)，每行分別標(biāo)號(hào)1~10。ⅱ）取中試管1支，再換一支吸管，（經(jīng)56℃30分鐘滅活）放入中試管內(nèi)，吸打混勻；（此時(shí)血清稀釋度為1：40）。ⅲ）吸取1：40的血清2ml。ⅳ）在中試管余下2ml血清中，再加入2ml生理鹽水，混勻（血清稀釋度為1：80）。然后吸取此1：80的血清2ml。ⅴ）按上述倍比稀釋，并依次加入各管，直至每行第9管（見(jiàn)表71）。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10HOPAPB1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 1∶1280 1∶2560 1∶5120 1∶10240 （） 表71 肥達(dá)氏反應(yīng)的加樣示意圖ⅵ）另取吸管1支，（對(duì)照管）ⅶ）按8…1列的順序，分別對(duì)第1行各孔加入0抗原1滴；第2行各孔加入H抗原1滴；同樣對(duì)第3行各孔加甲型副傷寒（PA）H抗原1滴；第4行各孔加乙型副傷寒（PB）H抗原1滴。由于抗原（菌液）的加入量少，可忽略不計(jì)。 ⅷ）將各孔混勻，置37℃水浴箱中2小時(shí)，取出置室溫過(guò)夜，次日觀察，判斷并分析結(jié)果。③結(jié)果觀察（見(jiàn)圖71）：根據(jù)凝集反應(yīng)的強(qiáng)弱，分別以“++++、+++、++、+”記錄：++++：液體清澈透明，菌體全部被凝成塊，沉于管底。+++：液體較透明，大部分菌體被凝集而沉于管底。++：液體稍透明，管底有少量凝集沉淀物。+：液體較混濁，可見(jiàn)極少量凝集物。：液體混濁，細(xì)菌因重力下降于管底呈邊緣光滑圓點(diǎn)（與對(duì)照管相似）。管底現(xiàn)象記錄方式圖71 肥達(dá)氏反應(yīng)的結(jié)果判定血清效價(jià)（或滴度）：能與一定量的抗原發(fā)生肉眼可見(jiàn)的明顯凝集（即“++”凝集）的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為血清的效價(jià)。血清的效價(jià)代表著血清中抗體的含量，其效價(jià)愈高，所含抗體的量愈多。如血清最低稀釋倍數(shù)（1∶40）仍無(wú)凝集，則視為陰性或效價(jià)低于1∶40；如血清的最高稀釋倍數(shù)（1∶1280）仍完全凝集，則示血清效價(jià)高于1∶1280。④結(jié)果分析：?。┦紫葢?yīng)考慮當(dāng)?shù)卣Ｈ诵r(jià)（正常效價(jià)）。一般以單份血清凝集效價(jià)：0效價(jià)應(yīng)達(dá)1：80以上、H效價(jià)應(yīng)在1：160以上，PA和PB應(yīng)達(dá)1：40以上方有診斷價(jià)值；若病程中第2次血清效價(jià)比第1次高4倍以上亦有診斷價(jià)值。ⅱ）由于H凝集素在血內(nèi)保持時(shí)間較久，0凝集素較短暫，所以曾接種過(guò)傷寒、副傷寒菌苗者，0凝集效價(jià)在診斷上較重要。ⅲ）真正的傷寒病人，0凝集素常較H凝集素出現(xiàn)早、但維持時(shí)間較短；H凝集素出現(xiàn)較晚、但效價(jià)較高且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。ⅳ）回憶反應(yīng)：過(guò)去曾接種過(guò)傷寒、副傷寒菌苗或患過(guò)傷寒、副傷寒病，近期又發(fā)生感染如流感、肝炎、結(jié)核病等，可非特異地產(chǎn)生較高的H凝集素和較低的0凝集素，此現(xiàn)象稱為回憶反應(yīng)。ⅴ）若0效價(jià)高而H不高（對(duì)正常效價(jià)而言），則可能是感染早期或與傷寒桿菌0抗原有交叉反應(yīng)的其他沙門菌感染。ⅵ）確診為傷寒的患者中，約有10%的患者該試驗(yàn)始終陰性或效價(jià)不高，故陰性結(jié)果不能排除傷寒的診斷。ⅶ）采血時(shí)間不同，肥達(dá)式反應(yīng)的陽(yáng)性率也不同。發(fā)病第1周約為50%；第2周80%；第4周90%以上?；謴?fù)期效價(jià)最高，以后逐漸下降，直至轉(zhuǎn)陰。一般以雙份血清（急性期和恢復(fù)期）對(duì)比，效價(jià)有明顯上升者作為新近感染的指征。1. 觀察大腸桿菌（或痢疾桿菌/傷寒桿菌）革蘭氏染色形態(tài)示教片2. 腸道致病菌的分離鑒定（一）（1）介紹腸道致病菌的分離鑒定程序（圖72）（2）分離培養(yǎng)與鑒定具體方法①取材：挑取黏液膿血樣糞便置清潔容器內(nèi)立即送檢。若不能及時(shí)送檢，應(yīng)用甘油緩沖鹽水保存。若無(wú)法獲取糞便時(shí)，用肛拭子檢查（用無(wú)菌棉拭子經(jīng)生理鹽水濕潤(rùn)后，插入肛門4~5cm處輕輕沿肛壁擦拭一圈后取出，放入含少量甘油緩沖鹽水的無(wú)菌試管中送檢。②糞便標(biāo)本或肛拭子可直接在SS瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)（常用三區(qū)劃線法，詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)）。對(duì)血、骨髓、尿等標(biāo)本可先做增菌培養(yǎng)，然后取增菌培養(yǎng)物在上述平板上劃線分離，經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。 2．SS平板分離培養(yǎng)（方法同前）三區(qū)劃線時(shí)注意：無(wú)菌操作。 劃線角度準(zhǔn)確，輕而快。 分區(qū)合理； 接種環(huán)適時(shí)處理；培養(yǎng)基正確放置，作好標(biāo)記.。血清學(xué)鑒定取可疑 菌落G染色鏡檢SS瓊脂平板培養(yǎng)基其他生化鑒定雙糖鐵培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基糞便標(biāo)本血清學(xué)鑒定取可疑 菌落G染色鏡檢SS瓊脂平板培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)血、骨髓、尿其他生化鑒定雙糖鐵培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基糞便標(biāo)本圖72 腸道致病菌的分離鑒定程序附. 有關(guān)培養(yǎng)基及試劑的配制：（1）肉湯培養(yǎng)基：新鮮肉浸液1000ml、蛋白胨10mg、氯化鈉5g，~，分裝于100ml疫瓶中，每瓶50ml，高壓滅菌后備用。該培養(yǎng)基適合于各類細(xì)菌的增菌培養(yǎng)。（2）SS瓊脂平板：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、瓊脂20g、枸櫞酸鐵1g、%、1%、蒸餾水1000ml。除了煌綠、中性紅以外，將其它各成分混合于蒸餾水中，加熱溶化，再加入煌綠和中性紅，分裝于三角燒瓶中，待冷至50℃左右，傾注于無(wú)菌平板中，冷后備用。適合于糞便標(biāo)本中腸道