【正文】 ?獼猴 生物制品的標(biāo)準(zhǔn)化 生物制品的質(zhì)量檢定 ? 生物制品的理化檢定 ? 生物制品的安全檢定 ? 生物制品的效力檢定 生物制品的質(zhì)量檢定 ? 生物制品的理化檢定 ?參照 《 生物制品化學(xué)檢定規(guī)程 》 ?物理性狀檢查 ?蛋白質(zhì)含量測定 ?防腐劑含量測定 ?純度檢查 ?其它 ?外觀 ?真空度及溶解時間 半微量定氮法 酚試劑法 ?紫外吸收法 ?苯酚含量測定 ?汞類防腐劑含量測定 ?氯仿含量測定 ?游離甲醛含量測定 ?區(qū)帶電泳 ?免疫電泳 ?凝膠層析 ?水份含量測定 ?氫氧化鋁與磷酸鋁含量測定 ?磷含量測定 ?O乙酰基含量測定 ? 生物制品的安全檢定 ?一般安全性檢查 ?殺菌、滅活和脫毒情況的檢查 ?外源性污染檢查 ?過敏性物質(zhì)檢查 生物制品的質(zhì)量檢定 第四節(jié)：生物制品的一般制造方法 ? 病毒類疫苗制造方法 疫苗制備工藝各異，但主要程序一致。 疫苗制備工藝流程 ? 毒株必須滿足的條件 ① 抗原性 ② 典型形態(tài)，感染特定組織 ③ 人工繁殖，不產(chǎn)生毒素 ④ 無毒力回復(fù) ⑤ 不被病毒感染 病毒繁殖 ?（ 1）活體動物培養(yǎng)：牛痘 牛皮下，乙腦 鼠腦等。生產(chǎn)中已淘汰。 ?（ 2）雞胚培養(yǎng)。較動物管理方便。易受支 原體，沙門菌污染。 ?（ 3）組織培養(yǎng)。廣泛用于病毒培養(yǎng)。 ?（ 4）細(xì)胞培養(yǎng)。 ? 疫苗的滅活 ?原則：充分破壞疫苗的毒力，盡量減少疫苗免疫力損失。 ?％－ ％的甲醛或酚溶液。 ? 疫苗的純化 ?去除存在的動物組織，降低接種不良反應(yīng)。 ? 凍干 ? 升華，不使疫苗融解。疫苗穩(wěn)定性提高 1倍以上。 細(xì)菌類疫苗和類毒素的一般制造方法 ?細(xì)菌類疫苗和類毒素均由細(xì)菌培養(yǎng)開始， 制備的主要程序相似。 細(xì)菌類疫苗對菌體進(jìn)一步加工 類毒素對細(xì)菌分泌的外毒素加工 疫苗和類毒素制備工藝流程 菌種的選擇 ① 抗原性 ② 典型形態(tài)，培養(yǎng)特性和理化特性 ③ 易于在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，不產(chǎn)生毒素 ④ 培養(yǎng)過程中毒性小或無毒力回復(fù) ⑤ 制備毒素時澤培養(yǎng)過程中產(chǎn)生大量的典型毒素 ? ? 碳、氮源和無機(jī)鹽等必需外，有時需添加生長因子。 ? 結(jié)核桿菌以甘油為碳源，百日咳桿菌需要谷氨酸，胱氨酸為氮源。 ? 培養(yǎng)條件控制 氧分壓、溫度、 pH、避光 ? 殺菌 ? 徹底殺死細(xì)菌不影響防病效力 ? 稀釋、分裝和凍干 ? 含防腐劑的 NS稀釋，無菌分裝。 生物制品的分包裝 ? 分裝 ?分裝前，檢定合格，標(biāo)簽完整，明確。 ?防止錯批，混批。 ?無菌操作，實(shí)際裝量多于標(biāo)簽示量。 ? 包裝 ?破漏檢查。 ?載名名稱、批號、亞批號、有效期等。 第五節(jié) 重要生物制品的制備 ?乙型肝炎疫苗的制備 ? 乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus， HBV） 屬嗜肝 DNA病毒科（ hepadnaviridae）。 ? HBV的發(fā)現(xiàn)源于表面抗原的研究。 1963年 Blumberg首先在澳大利亞土著人血清中發(fā)現(xiàn)一種新抗原，稱為澳大利亞抗原（ Australia antigen）；直至 1968年確定這種抗原與血清型肝炎密切相關(guān)，稱為肝炎相關(guān)抗原（ hepatitis associated antigen， HAA）； 1970年 . Dane在肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)具有傳染性的顆粒，即 Dane顆粒（ Dane39。s particle）。從而 HBV被確認(rèn)。 ? HBV是 乙型肝炎 病原體，主要經(jīng)輸血、注射、性行為和母嬰傳播。起病徐緩，部分患者可轉(zhuǎn)為慢性，少數(shù)還可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。 乙肝病毒發(fā)病區(qū)域 乙型肝炎病毒 形態(tài)與結(jié)構(gòu) 完整的 HBV顆粒亦稱Dane顆粒，直徑為 42nm，具有雙層核殼結(jié)構(gòu)： 核心顆粒 ：直徑為 28nm。 顆粒內(nèi)部： DNA和 DNA多聚酶 。 顆粒表面（內(nèi)衣殼）：含有 HBcAg 和 HBeAg 。 外殼（包膜） ：厚 7nm。 脂質(zhì)雙層：含有 HBsAg、PHSAr 和 PreSAg蛋白質(zhì) 乙肝疫苗的制備－血源疫苗 特點(diǎn) : (1)血源取得困難 。 (2)疫苗需經(jīng)安全試驗(yàn) ,故費(fèi)用大 ,生產(chǎn)周期達(dá) 65周 . (3)現(xiàn)已淘汰。 乙肝疫苗的制備－人工合成多肽疫苗 ?工藝過程 :人工合成 HBsAg的 P25多肽 ,并在 124與137位半胱氨酸殘基之間引入 SS,使成環(huán)狀多肽 ,用其免疫動物后 ,50%出現(xiàn)抗體應(yīng)答。 ?特點(diǎn) :純凈 ,不會污染其他病毒 ,無傳染性 ,原材料來源方便 ,但目前生產(chǎn)成本高 ,難以大量生產(chǎn)。 乙肝疫苗的制備－基因工程疫苗 工藝路線 : ?(1) 將 HBV的 DNA片段插入到質(zhì)粒并引入到 ,使其復(fù)制表達(dá)抗原物質(zhì)。 ?(2) 將 HBV的 DNA片段插入到牛痘病毒 ,再由此病毒重組體感染細(xì)胞 ,可分泌 HBsAg。 ?(3)用一含 HbsAg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO),在該細(xì)胞中表達(dá) HbsAg蛋白 ,釋放于培養(yǎng)液中 ,從培養(yǎng)液中提純抗原蛋白。 曾研究過用真核和原核細(xì)胞作為表達(dá)宿主，包括哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母、細(xì)菌和病毒等。 目前大規(guī)模生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母、畢赤酵母和漢遜酵母等基因工程疫苗，其次為 CHO細(xì)胞基因工程疫苗，還有 HBsAg+PreS2或HBsAg+PreS1+ PreS2（ CHO細(xì)胞和酵母表達(dá)系統(tǒng)）。 第六節(jié) 核酸疫苗 ? 概念 ?它是利用基因重組技術(shù)直接將編碼某種抗原蛋白的 外源基因 （ DNA）與 質(zhì)粒重組 后，直接導(dǎo)入 動物細(xì)胞 內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 發(fā)展歷史 ? 1990年 Wolff等偶然發(fā)現(xiàn)給小鼠肌肉注射外源性重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。 ? 1991年 Willams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。 ? 1992年 Tang等將表達(dá)人生長激素的基因質(zhì)粒 DNA導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。 ? 1993年 Ulmer等證實(shí)小鼠肌肉注射含有編碼甲型流感病毒核蛋白（ NP）的重組質(zhì)粒后，可有效地保護(hù)小鼠抗不同亞型、分離時間相隔 34年的流感病毒的攻擊。隨后的大量動物實(shí)驗(yàn)都說明在合適的條件下， DNA接種后既能產(chǎn)生細(xì)胞免疫又能引起體液免疫。 ? 1994年在 日內(nèi)瓦 召開的專題會議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的 第三次革命 。 DNA疫苗表達(dá)抗原 V I II III IV 1 2 gene (DNA) RNA antigen (protein) ?基因指導(dǎo)其編碼抗原的產(chǎn)生 ?抗原激活免疫反應(yīng) ?產(chǎn)生抗體 ?細(xì)胞免疫 優(yōu)缺點(diǎn) ?優(yōu)點(diǎn) ?無需純化蛋白 ?多次重復(fù)注射 ?構(gòu)建簡單 ?生產(chǎn)運(yùn)輸方便 ?缺點(diǎn) ?不知壽命 ?瞬間：需要重復(fù)注射 ?整合到染色體（變異） 下節(jié)課 第十章 動物細(xì)胞工程制藥工藝