不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(編輯修改稿)
2024-10-06 02:43 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 吸除培養(yǎng)液，再參加腫瘤條件培養(yǎng)液；每兩天換液一次。毛細(xì)血管小段一般成自 1 ~ 4 個內(nèi)皮細(xì)胞， 以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù) 2 ~ 5 天。 第二十八頁，共七十頁。 3．毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞別離培養(yǎng)： (1) 初代培養(yǎng) 2 ~ 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿反面，用不脫色筆劃圈圈起； (2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、翻開培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時間不宜過長 (15 ~ 20 分鐘 )；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮刮除； 第二十九頁，共七十頁。 (3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞； (4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小 (5 ~ 20 個細(xì)胞 ) 而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需參加 3T3等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為 4000 細(xì)胞／ cm2； (5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、參加腫瘤條件培養(yǎng)基； (6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng) (飼細(xì)胞死亡被淘汰 )，細(xì)胞增殖生長集合后，按 1:5 傳代。 第三十頁，共七十頁。 第三十一頁，共七十頁。 二、結(jié)締組織類細(xì)胞培養(yǎng) (一 ) 成纖維細(xì)胞培養(yǎng) ?包括人在內(nèi)的各種成纖維細(xì)胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。 ?用人或動物胚體為好；動物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。幼兒包皮是培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的很好對象。 第三十二頁，共七十頁。 小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件 ? ~； ?最佳答案培養(yǎng)基為 DMEM添加 15%小牛血清； ?第 3代細(xì)胞增殖最旺盛； ?室溫條件下， %胰蛋白酶消化時間以8~10min為宜。 ?在培養(yǎng) ES細(xì)胞時，應(yīng)選擇第 3~5代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。 第三十三頁，共七十頁。 小鼠成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞來源： swiss小鼠胚胎 第三十四頁，共七十頁。 第三十五頁，共七十頁。 (二 ) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) ? 巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。 ? 巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活 2 ~ 3周，因之多用作初代培養(yǎng) 。 ? 巨噬細(xì)胞也能建成無限細(xì)胞系；大多來自小鼠，如P388D J774A． RAW30 Cr. 1 等。 第三十六頁，共七十頁。 1．培養(yǎng)技術(shù)要點： ?[來源和取材 ] 巨噬細(xì)胞可來源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 ?實驗多從動物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動物腹腔取材最常用。用 40μg 的PHA 注入腹腔中，能產(chǎn)生 6 ~ 8 106 個細(xì)胞，而且無刺激性，效果較好。 第三十七頁，共七十頁。 2．培養(yǎng)方法： ? 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各種方法和各種來源獲取細(xì)胞，其中以小鼠腹腔取材法最為實用。人的材料除來源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。 ? [程序 ] (1) 實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯 1ml (勿注入腸內(nèi) )； (2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入 70％酒精中 3 ~ 5 秒； (3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁； (4) 再用 70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸 10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動； 第三十八頁，共七十頁。 (5) 用針頭輕輕挑起腹壁，使動物體微傾向一側(cè)，使腹腔中液體集于針頭下吸取入針管內(nèi)； (6) 小心拔出針頭，把液體注入離心管中， (4℃ )離心 10 分鐘后，去上清，加 10 ml Eagle 培養(yǎng)基； (7) 計數(shù)細(xì)胞，每只小鼠可產(chǎn)生 20 ~ 30 106 細(xì)胞，其中90％為巨噬細(xì)胞； (8) 為獲取 3 105 個貼附細(xì)胞／平方厘米，需接種 106／ m1； (9) 為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時后，去除培養(yǎng)液，用 Eagle 液沖洗 1 ~ 2 次后，再加新Eagle 培養(yǎng)液置 37℃ CO2 溫箱中培養(yǎng)。 第三十九頁，共七十頁。 第四十頁，共七十頁。 三、肌組織細(xì)胞培養(yǎng) ? 以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。 (一 ) 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng) ? 動物胚或幼體的 大腿肌組織為最好的培養(yǎng)材料 。取材常用生后 1 ~ 2 天的乳鼠 (Wistar 大鼠更好 )。 (1) 取材 ： 殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成 ~ 厘米小塊； (2)消化 ： 用不含鈣鎂離子的 Hanks 液配的 ％胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基加 10％小牛 (或馬 )血清培養(yǎng)， 為促進(jìn)分化可加 1％ 的胎汁； 第四十一頁，共七十頁。 (3)接種：細(xì)胞接種量
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