【正文】 ； 消化液在肝內(nèi)停留 20~ 30 分后，在吸出消化液的同時并輕柔壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出； 第十七頁，共七十頁。 第十四頁，共七十頁。 第十頁，共七十頁。 ?飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長，利于克隆的形成。 ?純化和延長上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。第六章 個別細(xì)胞和組織的培養(yǎng) 第一頁，共七十頁。 ?上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個難點： ?①需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層那么利于細(xì)胞生長； ?②需求特殊培養(yǎng)基； ?③與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時混雜生長，并常壓過上皮細(xì)胞。 ?飼細(xì)胞作用： ?有同化營養(yǎng)液的能力。 (5) 溫消化：取出表皮單獨處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的％胰蛋白酶中， 37℃ 再消化 30 ~ 60 分鐘； (6)制細(xì)胞懸液：用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液； (7) 加培養(yǎng)液：通過 80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接參加 Eagle 液和 20％小牛血清 . (8)培養(yǎng)：接種入碟皿中， CO2 溫箱培養(yǎng)。初代培養(yǎng)可維持 2 ~ 3 周，第一周末達(dá)頂峰，最后逐漸衰退剝落。 3．肝臟灌流法： ? 需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好 。 (3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為 ％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化 3 ~10 分鐘； (4) 吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫 PBS 沖洗 2 ~ 3 次徹底去除干凈剩余細(xì)胞，一并注入離心管中離心； (5) 吸除上清，加 1640 培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時 2 ~ 3 天內(nèi)細(xì)胞即可長成單層。 1．材料： [腫瘤條件培養(yǎng)基制備 ] (1) 取 C3H 小鼠的 S180 實體肉瘤組織； (2) 胰蛋白酶消化， Dulbecco 改進(jìn) Eagle 氏培養(yǎng)液 15m1 (含 10％小牛血清 ) 種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)； 第二十五頁，共七十頁。 3．毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞別離培養(yǎng)： (1) 初代培養(yǎng) 2 ~ 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿反面，用不脫色筆劃圈圈起； (2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、翻開培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時間不宜過長 (15 ~ 20 分鐘 )；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮刮除； 第二十九頁，共七十頁。 小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)條件 ? ~； ?最佳答案培養(yǎng)基為 DMEM添加 15%小牛血清； ?第 3代細(xì)胞增殖最旺盛； ?室溫條件下， %胰蛋白酶消化時間以8~10min為宜。 ? 巨噬細(xì)胞也能建成無限細(xì)胞系；大多來自小鼠，如P388D J774A． RAW30 Cr. 1 等。 ? [程序 ] (1) 實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯 1ml (勿注入腸內(nèi) )； (2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入 70％酒精中 3 ~ 5 秒； (3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁； (4) 再用 70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸 10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動； 第三十八頁，共七十頁。 (3)接種：細(xì)胞接種量為 2 106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。 第四十三頁，共七十頁。 神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在參加神經(jīng)生長因子 (NGF) 和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。 ? (一 ) 初代培養(yǎng) ? 神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細(xì)胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。 ?生長開始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連接不甚緊密的單層細(xì)胞 第五十五頁，共七十頁。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。 ?當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 (1) 可用 0． 5mg／ ml 的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； (2) 用 Hanks 洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純潔腫瘤細(xì)胞。 二、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施 1．適宜底物： ? 如：把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。 人乳腺癌細(xì)胞株 MCF7 第六十九頁，共七十頁