不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)-展示頁
2024-10-06 02:43本頁面
【正文】 (4) 別離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開； 第九頁，共七十頁。 第八頁，共七十頁。 第七頁，共七十頁。 ?飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長，利于克隆的形成。 ?【飼細(xì)胞】飼細(xì)胞 (Feeder Cells)也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。 ? 向培養(yǎng)基中加氫化可的松 (10 μg/m1)、 106M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和 10 ng/m1 促表皮生長因子 (EGF) 能促表皮細(xì)胞生長。 (一 )表皮細(xì)胞培養(yǎng) 1．特點(diǎn) ： ? 在有膠原的底物上易生長 ； ? 把人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以 3T3 細(xì)胞為飼養(yǎng)層 (用射線照射后 )上時，細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。 ?純化和延長上皮細(xì)胞生存期是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。 第四頁，共七十頁。 第三頁，共七十頁。 第一節(jié) 正常細(xì)胞培養(yǎng) ?正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時都 不易生長，建立細(xì)胞系更難。第六章 個別細(xì)胞和組織的培養(yǎng) 第一頁，共七十頁。 類型： 正常細(xì)胞培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 第二頁，共七十頁。 ?正常細(xì)胞難培養(yǎng)的 原因是它們是分化的細(xì)胞，對體外生存條件要求嚴(yán)格 . ?但只要一切條件適當(dāng)仍有培養(yǎng)成功可能。 一、上皮細(xì)胞類培養(yǎng) ?上皮細(xì)胞可來源于外、內(nèi)、中三個胚層； ?培養(yǎng)中只有源于外和內(nèi)胚層的細(xì)胞能反映出上皮細(xì)胞的特征，細(xì)胞呈膜狀生長的特點(diǎn)。 ?上皮細(xì)胞培養(yǎng)有三個難點(diǎn)： ?①需求特殊底物，如在底物上涂有膠原底層那么利于細(xì)胞生長； ?②需求特殊培養(yǎng)基； ?③與上皮細(xì)胞相鄰的成纖維細(xì)胞常與上皮細(xì)胞同時混雜生長，并常壓過上皮細(xì)胞。 第五頁，共七十頁。 ? 降低 pH、 Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細(xì)胞生長。 第六頁，共七十頁。 ?飼細(xì)胞作用： ?有同化營養(yǎng)液的能力。克隆形成后飼細(xì)胞漸死亡，換液時去除。 飼細(xì)胞的制備： (1)取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細(xì)胞， 90% 集合時制成細(xì)胞懸液，再按103 細(xì)胞 /毫升重新接種培養(yǎng)； (2)在細(xì)胞半集合時，準(zhǔn)備 絲裂霉素，按 2ug/105 細(xì)胞的量參加到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量 30～ 50 戈瑞 (Gy)； (3)細(xì)胞經(jīng)上述處理后， Hanks 液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng) 24 小時，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按 5 104/ml接種入新培養(yǎng)基中； (4)48 小時后，即可用于細(xì)胞克隆之用。 2．表皮細(xì)胞培養(yǎng)程序： (1) 取材：取外科植皮或手術(shù)剩余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，切成 ~ 1cm2小塊； (2) EDTA 處理：先置入 ％ EDTA 中室溫置 5 分鐘。 (5) 溫消化：取出表皮單獨(dú)處理；用剪刀剪成更小的塊后，置入新的％胰蛋白酶中， 37℃ 再消化 30 ~ 60 分鐘； (6)制細(xì)胞懸液：用吸管輕輕反復(fù)吹打，使成細(xì)胞懸液； (7) 加培養(yǎng)液：通過 80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸上清，直接參加 Eagle 液和 20％小牛血清 . (8)培養(yǎng)：接種入碟皿中， CO2 溫箱培養(yǎng)。 ?本卷須知：冷消化目的在于使表皮和真皮結(jié)合松散；如冷消化后別離下來的表皮膜自身也已松散，此時亦可直接置入 PBS 中用吸管吹打制備細(xì)胞懸液；不再經(jīng)過第二次消化。 (二 ) 胃上皮細(xì)胞培養(yǎng) ?適于胃上皮細(xì)胞生長的條件是： ① 膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細(xì)胞； ② 應(yīng)用膠原底物培養(yǎng)； ③ 制備含有特定成分的培養(yǎng)基； 第十二頁，共七十頁。 (5) 接種：末次離心后參加含有 1％ ~ 2％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，接種入不同孔數(shù)的培養(yǎng)板中；接種量依不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。初代培養(yǎng)可維持 2 ~ 3 周，第一周末達(dá)頂峰，最后逐漸衰退剝落。 (三 ) 肝細(xì)胞培養(yǎng) ?肝臟具有取材方便和易于生長的優(yōu)點(diǎn)，能獲得典型上皮細(xì)胞培養(yǎng)。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成 1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。 第十五頁，共七十頁。 3．肝臟灌流法： ? 需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好 。 (3) 待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心別離，用 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng) (較其它培養(yǎng)基為好 )，能獲得較純的肝上皮細(xì)胞和獲較好的效果。 (四 ) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) ?應(yīng)用材料： 人臍帶臍靜脈、動物大動脈等， 用灌流消化法獲取細(xì)胞最為簡便。 1. (1)取產(chǎn)后的新鮮臍帶；如不立即培養(yǎng)可保存于 4℃ 中，但不宜超過 12 小時； 無菌剪取長 10 ~ 15 厘米一段 。 (3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為 ％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化 3 ~10 分鐘； (4
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