不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)-資料下載頁
2024-10-06 02:43本頁面
【正文】 加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。 ? 培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。 第五十八頁，共七十頁。 3．成纖維細(xì)胞的排除： ?成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。 第五十九頁，共七十頁。 成纖維細(xì)胞排除法 1．機(jī)械刮除法： 是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭 (用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲 )，或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用 (也可用特制電熱燒灼器刮除 )。刮除程序?yàn)椋? (1) 標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的反面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位； (2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間； (3) 用 Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞； (5) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。 第六十頁，共七十頁。 2．反復(fù)貼壁法： 根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液， (1) 細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后， Hanks 沖洗 2 次，參加不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液； (2) 編號(hào)為 A、 B、 C 三個(gè)培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入 A 培養(yǎng)瓶中，置溫箱中靜止培養(yǎng) 5— 20 分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入 B 培養(yǎng)瓶中后；向 A 瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)； (3) B瓶中細(xì)胞 5~20 分鐘后，按處理 A 的方法，把培養(yǎng)液注入 C 培養(yǎng)瓶中；再向 B 瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。 第六十一頁，共七十頁。 ?當(dāng)三個(gè)瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見 A 瓶主要為成纖維細(xì)胞， B 瓶兩類細(xì)胞相雜， C 瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理屢次，直至癌細(xì)胞純化為止。 第六十二頁，共七十頁。 3．消化排除法： (1) 先是用 ％胰蛋白酶和 ％ EDTA (1:1) 混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化； (2) 把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后， 成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落 ，經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。 第六十三頁，共七十頁。 4．膠原酶消化法： 本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過消化進(jìn)行選擇。 (1) 可用 0． 5mg／ ml 的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； (2) 用 Hanks 洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純潔腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞末被除凈，可再次重復(fù)。 第六十四頁，共七十頁。 5．其它方法： 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重 ~ 的密度梯度離心液，參加細(xì)胞懸液后，在 23℃ 中 800g 離心 10 分鐘。在比重 ~ 層為成纖維細(xì)胞，在比重 ~ 層為上皮細(xì)胞，再經(jīng)過別離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如 SOD 抑制成纖維細(xì)胞生長的方法。 選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗(yàn)，取得必要經(jīng)驗(yàn)，找出適合的條件，才能獲得好的效果。 第六十五頁，共七十頁。 二、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率措施 1．適宜底物： ? 如：把經(jīng)過純化的細(xì)胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。 2．生長因子： ? 應(yīng)用促細(xì)胞生長因子，向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長因子。 3．動(dòng)物體媒介培養(yǎng)： ? 為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞 (干細(xì)胞 ) 的數(shù)量，可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后，再從動(dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng)，能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠最好。 第六十六頁，共七十頁。 Hela細(xì)胞 第六十七頁，共七十頁。 肝癌細(xì)胞 第六十八頁，共七十頁。 人乳腺癌細(xì)胞株 MCF7 第六十九頁，共七十頁。 內(nèi)容總結(jié) 第六章 個(gè)別細(xì)胞和組織的培養(yǎng)。正常細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時(shí)都不易生長，建立細(xì)胞系更難。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成 1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。毛細(xì)血管細(xì)小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細(xì)胞外有較多的結(jié)締組織，進(jìn)行別離培養(yǎng)有很大困難。動(dòng)物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)。神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡 第七十頁，共七十頁。
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