不同類型細胞的培養(yǎng)特點-免費閱讀
【正文】 毛細血管細小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細胞外有較多的結(jié)締組織，進行別離培養(yǎng)有很大困難。受體動物以裸鼠最好。在比重 ~ 層為成纖維細胞，在比重 ~ 層為上皮細胞，再經(jīng)過別離進行培養(yǎng)。 3．消化排除法： (1) 先是用 ％胰蛋白酶和 ％ EDTA (1:1) 混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化； (2) 把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。刮除程序為： (1) 標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的反面圈下生長腫瘤細胞的部位； (2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間； (3) 用 Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞； (5) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應性較大。 培養(yǎng)方法 腫瘤細胞培養(yǎng)成功關鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。 (三 ) 培養(yǎng)方法 人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來自手術室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)， 1．程序： (1) 細胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入 Hanks 液中漂洗 1 ~ 2 次后，置于 30 ~ 50倍的 Hanks 液中；腦組織比較柔軟，反復吹打即可制備成細胞懸液； (2) 排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在室溫直立 5 ~ 10 分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復二三次可獲較多的細胞成分； 第五十三頁，共七十頁。 第四十八頁，共七十頁。 第四十四頁，共七十頁。一般在融合后二三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象；因收縮運動有時可導致細胞從底物脫離。 三、肌組織細胞培養(yǎng) ? 以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。用 40μg 的PHA 注入腹腔中，能產(chǎn)生 6 ~ 8 106 個細胞，而且無刺激性，效果較好。 第三十五頁，共七十頁。 二、結(jié)締組織類細胞培養(yǎng) (一 ) 成纖維細胞培養(yǎng) ?包括人在內(nèi)的各種成纖維細胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。 2．初代培養(yǎng) (1) 取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用 Hanks 液洗除血污； (2) 消化：剝除被膜，別離出皮質(zhì)，切成 l mm3 小塊，加 ％膠原酶室溫中消化 1 小時；每隔 10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分； (3)過濾：通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允許能通過小于 110 微米長的毛細血管小段； (4)離心： 650 rpm， 4℃ ，離心 7 分鐘后，棄掉上清膠原酶； 第二十七頁，共七十頁。用兔血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)較好，可傳 10 ~ 30 代； ?不同部位血管內(nèi)皮細胞生物學性狀不同，對各種作用因素反響亦有很大差異。 (四 ) 內(nèi)皮細胞培養(yǎng) ?應用材料： 人臍帶臍靜脈、動物大動脈等， 用灌流消化法獲取細胞最為簡便。取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝剪成 1mm3 左右的小塊，采用貼壁培養(yǎng)法。 (二 ) 胃上皮細胞培養(yǎng) ?適于胃上皮細胞生長的條件是： ① 膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法并用消化細胞； ② 應用膠原底物培養(yǎng)； ③ 制備含有特定成分的培養(yǎng)基； 第十二頁，共七十頁。 飼細胞的制備： (1)取原代培養(yǎng)的人或動物胚胎成纖維細胞， 90% 集合時制成細胞懸液，再按103 細胞 /毫升重新接種培養(yǎng)； (2)在細胞半集合時，準備 絲裂霉素，按 2ug/105 細胞的量參加到培養(yǎng)瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量 30～ 50 戈瑞 (Gy)； (3)細胞經(jīng)上述處理后， Hanks 液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng) 24 小時，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按 5 104/ml接種入新培養(yǎng)基中； (4)48 小時后，即可用于細胞克隆之用。 ? 降低 pH、 Ca2+的含量和溫度等，均利于表皮細胞生長。 ?正常細胞難培養(yǎng)的 原因是它們是分化的細胞，對體外生存條件要求嚴格 . ?但只要一切條件適當仍有培養(yǎng)成功可能。 第三頁，共七十頁。 ? 向培養(yǎng)基中加氫化可的松 (10 μg/m1)、 106M的異丙基腎上腺素(Isoproterenol) 和 10 ng/m1 促表皮生長因子 (EGF) 能促表皮細胞生長。 第八頁，共七十頁。 ? 培養(yǎng)程序： ? (1) 取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區(qū)粘膜少許； ? (2) 清洗：用含慶大霉素 (400μg/m1)和兩性霉素(2μg/m1 的 Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成 1mm大??； ? (3) 消化：在 I 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于 37℃ 中消化 80 分鐘； ?
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