不同類型細胞的培養(yǎng)特點-預(yù)覽頁
【正文】 倒置顯微鏡下挑除；用細胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、翻開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長 (15 ~ 20 分鐘 )；圈外非內(nèi)皮細胞可用無菌膠刮刮除； 第二十九頁，共七十頁。 二、結(jié)締組織類細胞培養(yǎng) (一 ) 成纖維細胞培養(yǎng) ?包括人在內(nèi)的各種成纖維細胞都很容易培養(yǎng)，也是其它組織培養(yǎng)時的副產(chǎn)物，極易獲得。 小鼠成纖維細胞培養(yǎng)條件 ? ~； ?最佳答案培養(yǎng)基為 DMEM添加 15%小牛血清； ?第 3代細胞增殖最旺盛； ?室溫條件下， %胰蛋白酶消化時間以8~10min為宜。 第三十五頁，共七十頁。 ? 巨噬細胞也能建成無限細胞系；大多來自小鼠，如P388D J774A． RAW30 Cr. 1 等。用 40μg 的PHA 注入腹腔中，能產(chǎn)生 6 ~ 8 106 個細胞，而且無刺激性，效果較好。 ? [程序 ] (1) 實驗前三天，向每只小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫基乙酸肉湯 1ml (勿注入腸內(nèi) )； (2) 引頸殺死動物；手提鼠尾將全鼠浸入 70％酒精中 3 ~ 5 秒； (3) 置動物于解剖臺上，用針頭固定四肢，雙手持鑷撕開皮膚拉向兩側(cè)，暴露出腹膜，但勿傷及腹膜壁； (4) 再用 70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸 10ml Eag1e 液注入腹腔中，同時從兩側(cè)用手指揉壓腹膜壁，令液體在腹腔內(nèi)充分流動； 第三十八頁，共七十頁。 三、肌組織細胞培養(yǎng) ? 以心肌和骨骼肌培養(yǎng)較為實用。 (3)接種：細胞接種量為 2 106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細胞分化。一般在融合后二三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象；因收縮運動有時可導致細胞從底物脫離。 第四十三頁，共七十頁。 第四十四頁，共七十頁。 神經(jīng)元為高度分化的細胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在參加神經(jīng)生長因子 (NGF) 和膠質(zhì)細胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。 第四十八頁，共七十頁。 ? (一 ) 初代培養(yǎng) ? 神經(jīng)元能發(fā)生一定分化現(xiàn)象，如生長突起，但因無增殖能力，最后衰退死亡；但神經(jīng)膠質(zhì)尤以星形細胞能繼續(xù)生存和分裂增殖。 (三 ) 培養(yǎng)方法 人腦組織可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)組織來自手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)均可用于培養(yǎng)， 1．程序： (1) 細胞懸液制備：獲取腦組織后，先仔細剝除腦膜和血管等纖維成分，置入 Hanks 液中漂洗 1 ~ 2 次后，置于 30 ~ 50倍的 Hanks 液中；腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即可制備成細胞懸液； (2) 排除脂肪成分和其它碎塊：把懸液注入離心管中，在室溫直立 5 ~ 10 分鐘后，細胞或細胞團塊自然下沉，脂肪等雜物易漂浮于懸液表層，吸除上清，如此反復(fù)二三次可獲較多的細胞成分； 第五十三頁，共七十頁。 ?生長開始常雜有巨噬細胞、成纖維細胞和上皮細胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細胞，一般形成連接不甚緊密的單層細胞 第五十五頁，共七十頁。 培養(yǎng)方法 腫瘤細胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。腫瘤細胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長。刮除程序為： (1) 標記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的反面圈下生長腫瘤細胞的部位； (2) 刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標記空間； (3) 用 Hanks 液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞； (5) 注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。 ?當三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 3．消化排除法： (1) 先是用 ％胰蛋白酶和 ％ EDTA (1:1) 混合液漂洗培養(yǎng)細胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化； (2) 把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 (1) 可用 0． 5mg／ ml 的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發(fā)現(xiàn)成纖維細胞被除掉后，即終止消化； (2) 用 Hanks 洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純潔腫瘤細胞。在比重 ~ 層為成纖維細胞，在比重 ~ 層為上皮細胞，再經(jīng)過別離進行培養(yǎng)。 二、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率措施 1．適宜底物： ? 如：把經(jīng)過純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。受體動物以裸鼠最好。 人乳腺癌細胞株 MCF7 第六十九頁，共七十頁。毛細血管細小，結(jié)構(gòu)簡單，內(nèi)皮細胞外有較多的結(jié)締組織，進行別離培養(yǎng)有很大困難
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