不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)-文庫(kù)吧資料
2024-10-06 02:43本頁(yè)面
【正文】 ) 為獲取 3 105 個(gè)貼附細(xì)胞／平方厘米，需接種 106／ m1； (9) 為純化培養(yǎng)細(xì)胞，去除其它白細(xì)胞，接種數(shù)小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，用 Eagle 液沖洗 1 ~ 2 次后，再加新Eagle 培養(yǎng)液置 37℃ CO2 溫箱中培養(yǎng)。人的材料除來(lái)源不同外，培養(yǎng)方法大同小異。 第三十七頁(yè)，共七十頁(yè)。 ?實(shí)驗(yàn)多從動(dòng)物血液、肺、脾和胸腹腔獲取，其中以從動(dòng)物腹腔取材最常用。 第三十六頁(yè)，共七十頁(yè)。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長(zhǎng)期生存，好的條件下僅能生活 2 ~ 3周，因之多用作初代培養(yǎng) 。 (二 ) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) ? 巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。 小鼠成纖維細(xì)胞； 細(xì)胞來(lái)源： swiss小鼠胚胎 第三十四頁(yè)，共七十頁(yè)。 ?在培養(yǎng) ES細(xì)胞時(shí)，應(yīng)選擇第 3~5代的小鼠成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。 第三十二頁(yè)，共七十頁(yè)。 ?用人或動(dòng)物胚體為好；動(dòng)物可用小鼠或雞胚，去頭和內(nèi)臟，剪成小碎塊后，用胰蛋白酶消化法培養(yǎng)；如為人胚，可取皮膚培養(yǎng)。 第三十一頁(yè)，共七十頁(yè)。 (3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞； (4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小 (5 ~ 20 個(gè)細(xì)胞 ) 而少時(shí)，生長(zhǎng)增殖常變得緩慢或完全不生長(zhǎng)，此時(shí)需參加 3T3等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為 4000 細(xì)胞／ cm2； (5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、參加腫瘤條件培養(yǎng)基； (6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng) (飼細(xì)胞死亡被淘汰 )，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)集合后，按 1:5 傳代。 第二十八頁(yè)，共七十頁(yè)。 (5)再離心：沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次； (6) 制細(xì)胞懸液：末次沉淀物仍用含 10％小牛血清的 Dulbecco 改進(jìn) Eag1e 氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打； (7)接種：接種入鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中， 37℃ 培養(yǎng)；在培養(yǎng)頭 1 ~ 3 小時(shí)中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞最先貼附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂?。? (8)換液：吸除培養(yǎng)液，再參加腫瘤條件培養(yǎng)液；每?jī)商鞊Q液一次。 第二十六頁(yè)，共七十頁(yè)。 (3) 在細(xì)胞生長(zhǎng)接近完全集合時(shí)，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含 10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養(yǎng)基； (4) 4000 轉(zhuǎn)／別離心后，再通過(guò) 微孔濾膜濾過(guò)， 20℃ 凍存?zhèn)溆?(臨用前融解 )。 ?近年毛細(xì)血管培養(yǎng)已獲成功； ?利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織 (如卵巢癌 ) 等均可； 第二十四頁(yè)，共七十頁(yè)。 第二十三頁(yè)，共七十頁(yè)。 ?人臍帶易于獲得，培養(yǎng)效果好；細(xì)胞生長(zhǎng)后，一般傳 6 ~ 7 代后即衰退，難以長(zhǎng)期維持。 第二十一頁(yè)，共七十頁(yè)。 2. 其它如胚胎和幼體動(dòng)物的大血管，亦可用于培養(yǎng)； (2) 先用三通注射器吸 溫 PBS 液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血 ；注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流； 第二十頁(yè)，共七十頁(yè)。 第十九頁(yè)，共七十頁(yè)。 第十八頁(yè)，共七十頁(yè)。 (1) 無(wú)菌解剖動(dòng)物，取出肝臟，先用 BSS 洗除血污； (2) 取 5ml 注射器一支，吸取消化液后，把 注射器頭輕輕插入肝管中 ，用線繩結(jié)扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入膽管系統(tǒng)，并不時(shí)輕柔壓肝臟，以便消化液進(jìn)入肝小葉中； 消化液在肝內(nèi)停留 20~ 30 分后，在吸出消化液的同時(shí)并輕柔壓肝臟，以使肝細(xì)胞脫落和消化液吸出； 第十七頁(yè)，共七十頁(yè)。 2．初代消化法培養(yǎng)： (1) 把肝組織切成 2 ~ 4 立方毫米的小塊，用不合鈣鎂的BSS 液洗兩次； (2) 移入 1:1 的 ％胰蛋白酶和 ％膠原酶 (都用無(wú)鈣鎂 BSS 配制 ) 中， 4℃ 冷消化 10 ~ 12 小時(shí)后，通過(guò) 250 微米和 64 微米尼龍網(wǎng)或不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò) (用紗布濾過(guò)亦可 )； (3) 收集細(xì)胞、 BSS 液洗 1 ~ 2 次、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)； 第十六頁(yè)，共七十頁(yè)。肝組織易于貼壁，生長(zhǎng)力好，一般次日即可出現(xiàn)生長(zhǎng)暈。 1．初代組織塊培養(yǎng)： ?肝組織做組織塊培養(yǎng)效果很好。 第十四頁(yè)，共七十頁(yè)。 細(xì)胞接種后一般在 16 小時(shí)內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多角形，成島狀或片狀生長(zhǎng)，以后逐漸聯(lián)接成片。 ? 培養(yǎng)程序： ? (1) 取材：取胃潰瘍或胃癌手術(shù)切除胃標(biāo)本遠(yuǎn)端非病變區(qū)粘膜少許； ? (2) 清洗：用含慶大霉素 (400μg/m1)和兩性霉素(2μg/m1 的 Hanks)液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成 1mm大??； ? (3) 消化：在 I 型膠原酶和透明質(zhì)酸酶中，于 37℃ 中消化 80 分鐘； ? (4) 離心：收集細(xì)胞懸液， 800 轉(zhuǎn) /別離心后， Hanks 液漂洗兩次； 第十三頁(yè)，共七十頁(yè)。 第十一頁(yè)，共七十頁(yè)。 第十頁(yè)，共七十頁(yè)。 (3) 冷消化：換入 % 胰蛋白酶中，置 4℃過(guò)夜；
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