【正文】 人乳腺癌細(xì)胞株 MCF7 第六十九頁，共七十頁。 (1) 可用 0． 5mg／ ml 的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化； (2) 用 Hanks 洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純潔腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。 ?生長開始常雜有巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，傳二、三代后，這些成分即消失，逐漸形成均一的星形膠質(zhì)細(xì)胞，一般形成連接不甚緊密的單層細(xì)胞 第五十五頁，共七十頁。 神經(jīng)元為高度分化的細(xì)胞，在組織發(fā)生晚期已失掉增殖能力，對生存條件要求高，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或在參加神經(jīng)生長因子 (NGF) 和膠質(zhì)細(xì)胞因子時，才能生存，并可能出現(xiàn)一定程度的分化現(xiàn)象，如長出突起等，但卻難使之增殖；即使培養(yǎng)胚胎組織情況也是如此。 (3)接種：細(xì)胞接種量為 2 106/皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化。 ? 巨噬細(xì)胞也能建成無限細(xì)胞系；大多來自小鼠，如P388D J774A． RAW30 Cr. 1 等。 3．毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞別離培養(yǎng)： (1) 初代培養(yǎng) 2 ~ 3 天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿反面，用不脫色筆劃圈圈起； (2) 鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除；用細(xì)胞解剖器也可，宜在凈化臺無菌氣流中、翻開培養(yǎng)皿蓋進(jìn)行，但時間不宜過長 (15 ~ 20 分鐘 )；圈外非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮刮除； 第二十九頁，共七十頁。 (3) 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為 ％的膠原酶，待末端出現(xiàn)液體后結(jié)扎之，令充滿血管，注入口亦應(yīng)結(jié)扎，以防液體返流，消化 3 ~10 分鐘； (4) 吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，注入離心管中；為獲取更多細(xì)胞，可再注入溫 PBS 沖洗 2 ~ 3 次徹底去除干凈剩余細(xì)胞，一并注入離心管中離心； (5) 吸除上清，加 1640 培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，接種入瓶皿中培養(yǎng)，順利時 2 ~ 3 天內(nèi)細(xì)胞即可長成單層。初代培養(yǎng)可維持 2 ~ 3 周，第一周末達(dá)頂峰，最后逐漸衰退剝落。 ?飼細(xì)胞作用： ?有同化營養(yǎng)液的能力。第六章 個別細(xì)胞和組織的培養(yǎng) 第一頁，共七十頁。 ?飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長，利于克隆的形成。 第十四頁，共七十頁。 第二十一頁，共七十頁。 (3) 用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞； (4) 剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如小 (5 ~ 20 個細(xì)胞 ) 而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需參加 3T3等飼細(xì)胞；飼細(xì)胞接種量為 4000 細(xì)胞／ cm2； (5) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、參加腫瘤條件培養(yǎng)基； (6) 接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng) (飼細(xì)胞死亡被淘汰 )，細(xì)胞增殖生長集合后，按 1:5 傳代。 第三十六頁，共七十頁。 明膠制備比較簡單，常用 Hanks 液配的 ％明膠。 第四十七頁，共七十頁。 第二節(jié) 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) ?腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞，當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。如成纖維細(xì)胞末被除凈，可再次重復(fù)。 內(nèi)容總結(jié) 第六章 個別細(xì)胞和組織的培養(yǎng)。 肝癌細(xì)胞 第六十八頁，共七十頁。 4．膠原酶消化法： 本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過消化進(jìn)行選擇。 3．成纖維細(xì)胞的排除： ?成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。 2．生長特點(diǎn)： ?接種后初期，細(xì)胞可能出現(xiàn)飄浮不貼壁現(xiàn)象，貼壁后在短期內(nèi)也可能不見細(xì)胞分裂現(xiàn)象；細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，然而一旦生長后，即能進(jìn)入較旺盛的增殖狀態(tài)。 四、神經(jīng)組織細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)組織主要由兩種神經(jīng)細(xì)胞 (神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞〕組成。 (1) 取材 ： 殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成 ~ 厘米小塊； (2)消化 ： 用不含鈣鎂離子的 Hanks 液配的 ％胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過，合成培養(yǎng)基加 10％小牛 (或馬 )血清培養(yǎng)， 為促進(jìn)分化可加 1％ 的胎汁； 第四十一頁，共七十頁。但屬不繁殖型細(xì)胞群，難以長期生存，好的條件下僅能生活 2 ~ 3周，因之多用作初代培養(yǎng) 。 第二十八頁，共七十頁。 2. 其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養(yǎng)； (2) 先用三通注射器吸 溫 PBS 液注入臍帶的臍靜脈中，洗除殘血 ；注入口處宜用線繩結(jié)扎，以防液體返流； 第二十頁，共七十頁。 細(xì)胞接種后一般在 16 小時內(nèi)貼壁，細(xì)胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯(lián)接成片。 ?【飼細(xì)胞】飼細(xì)胞 (Feeder Cells)也稱滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過射線照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物