【文章內(nèi)容簡介】 PKB /蛋白激酶b等信號的傳導,促進細胞的存活,結果對動物性的心肌缺血是有益的(Fujio et al., 2000).其他的關于轉基因模型和全球腦缺血、心肌缺血的研究表明這種抑制BAX的表達和（或）功能可以防止細胞色素c的釋放,抑制線粒體膜電位的減少,保護細胞與凋亡(Hochhauser et al., 2003。 Hetz et al., 2005) 這里提到的潛在的治療，僅僅代表一些過去的形式和目前的研究成果和領域。隨著細胞凋亡的分子和生化復雜性的繼續(xù)發(fā)展,新的治療策略也將繼續(xù)發(fā)展。顆粒細胞凋亡發(fā)生的凋亡是通過一個復雜的信號級聯(lián)反應,有著多種管制系統(tǒng),有許多機遇來評價與之有關的蛋白質(zhì)的活性。因為此次串聯(lián)反應的激活劑,影響因素和監(jiān)管機構的能夠被證明,可以設計大數(shù)目的細胞凋亡的檢測來檢測細胞凋亡。然而細胞凋亡和壞死的許多的特點可重疊,因此使用兩個或兩個以上的不同檢測來證實細胞的死亡是通過細胞凋亡至關重要。一個分析可能發(fā)現(xiàn)早(啟動)凋亡的事件，而不同的目標檢測或許可以發(fā)現(xiàn)稍后(執(zhí)行)事件。這第二個檢測法,用于確定凋亡,一般都是基于一個不同的原則。多路復用,就是能夠聚集超過一個數(shù)據(jù)集的同一樣品,另一個方法是,使細胞凋亡檢測變得越來越流行。有大量的可獲得的數(shù)據(jù),但每一個可用的分析化驗都各有其優(yōu)缺點?？梢越邮芤粋€應用程序,對于其它程序則不適用(Watanabe et al., 2002。 Otsuki et al., 2003)。因此,在研究細胞凋亡的機制的方法的選擇時，在細胞、組織或器官,理解優(yōu)缺點分析是至關重要的。理解每個細胞死亡的動力學模型體系是十分關鍵的。某些蛋白質(zhì),如caspases,只有在突變時才會表達。接受體外培養(yǎng)的凋亡細胞最終會進行二次壞死。在任何一個系統(tǒng)中凋亡細胞都會死亡，且消失相對快速。從開始發(fā)生凋亡到完成此過程可以快到2 3個小時。因此, 檢測做得太早或是太晚會導致一些錯誤的負面的消息。此外,細胞凋亡可發(fā)生在低頻的或器官、組織與文化背景的特定的某地點。在這種情況下, 大部分地區(qū)快速調(diào)查的能力是很有用的。一般來說,如果詳細的信息的機制,是理想的細胞死亡,持續(xù)時間的毒素暴露,測試化合物的濃度,選擇測定端點變得舉足輕重。詳細描述所有的檢測方法和顆粒細胞凋亡是超越這篇文章的范圍。然而,最常見的一些使用檢測方法這里將被提及并簡要描述。基于細胞凋亡測定等方法,可分為六大組織和一個子集可,每組進行了簡要論述。1。Cytomorphological改變2。DNA碎片3。檢測,貼近還基質(zhì)、監(jiān)管機構和抑制劑4。膜改變5。檢測細胞凋亡的整個坐騎6。線粒體分析Cytomorphological改變，hematoxylin的評價和eosinstained組織部分與光學顯微鏡都是不一樣的，允許細胞凋亡的可視化。盡管一凋亡細胞能被檢測到。這種方法與其他方法,確認可能是必要的。因為形態(tài)細胞凋亡是快速的。片段可以很快被吞噬。在某些組織細胞凋亡可能發(fā)生之前，phagocytized可觀,組織學明顯。另外,這個方法只能檢測事件的后期,所以細胞凋亡在早期階段不會被檢測到。光學顯微鏡下，藍色或亞甲藍染色可作為強烈的細胞凋亡評價標準。這種方法取決發(fā)生在細胞凋亡機制時，核和胞質(zhì)的凝結。組織和細胞的細節(jié)都保存在該技術調(diào)查地區(qū)的大型組織的獨特優(yōu)勢中。然而,凋亡小體不自動探測與健康細胞密度大顆粒胞被誤認為是細胞凋亡或碎片。此外,在處理過程中喪失antigenicity這樣immunohistological或酶檢測不能履行在同一組織。然而,這種組織可以用于透射電子顯微鏡(TEM)。瞬變電磁法(TEM)被認為是確定凋亡的黃金標準。這是因為細胞凋亡的分類是無可置疑的，如果細胞超微結構的形態(tài)包括一些特性(White and Cinti,2004)。這些特征:(1)electrondense核(一定是在早期)。(2)核分裂。(3)完整的細胞膜均勻細胞分化晚階段。(4)細胞質(zhì)細胞器紊亂。(5)大清晰液泡。(6)blebs于細胞表面。因為細胞凋亡的進展,就會失去細胞間的粘連,將獨立于鄰近的細胞。在以后的凋亡階段、細胞凋亡小體的碎片進入完整的細胞膜上,而它們有的也會含有胞質(zhì)細胞器或沒有核碎片。吞噬凋亡細胞與也要靠TEM。瞬變電磁法(TEM)的主要弊端是成本、時間開支,并且能夠只檢測一個狹小的區(qū)域。其他缺點包括窗體頂端在檢測凋亡細胞由于其短暫性的困難和無法檢測在最初階段的細胞凋亡。DNA片段DNA梯狀條帶技術是用于可視化的內(nèi)切酶裂解產(chǎn)物細胞凋亡（韋理夫人，1980年）。這個實驗涉及從裂解細胞勻漿提取DNA其次是瓊脂糖凝膠電泳。在一個典型的“DNA梯狀”這結果大小分開，由約180個堿基對中的每個波段的階梯。這種方法很容易執(zhí)行，靈敏度為1 106個細胞（即，檢測水平，是數(shù)百萬細胞），并負責組織和每個組織的細胞凋亡與細胞培養(yǎng)有用質(zhì)量或體積。另一方面，它是不建議在低的情況下凋亡細胞的數(shù)量。有這種檢測等弊端。由于DNA碎片發(fā)生在細胞凋亡的后期階段，沒有一個DNA梯狀不消除潛在的細胞發(fā)生早期凋亡。此外，DNA的碎片可能會發(fā)生在使其難以產(chǎn)生一個核小體的階梯準備和壞死細胞也能產(chǎn)生的DNA片段。TUNEL法（終端的dUTP缺口末端標記）方法用于檢測內(nèi)切酶裂解酶末端標記的DNA鏈斷裂（Kressel和產(chǎn)品格羅斯庫特，1994年，伊藤和乙木，1998年）。末端轉移酶是用來添加標記的UTP339。 末端的DNA片段。允許的dUTP可以被貼上各種探頭通過光鏡，熒光顯微鏡或流式細胞儀（圖4）的檢測。 “分析套件，可以從各種各樣的公司收購。此試劑盒也非常敏感，可以探測一個單細胞通過熒光顯微鏡或盡可能少?100個細胞，通過流式細胞儀。它也是一個快速的技術，可在3小時內(nèi)完成。缺點是成本和未知參數(shù)多少DNA鏈斷裂用這種方法檢測的必要。這種方法也從誤報壞死細胞和細胞中的DNA修復和基因轉錄的過程?；谶@些原因，應該與其他檢測配對。檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，切割基板，穩(wěn)壓器和抑制劑有超過13個已知的凋亡（procaspases或活性半胱氨酸半胱氨酸蛋白酶），可檢測caspase活性檢測的各類（Gurtu等，1997）。也有免疫組織化學檢測，可以檢測如PARP的和已知的細胞裂解基板修飾，如磷酸化的組蛋白（圖5A）（Love等，1999。 Talasz等。2002年）。熒光標記的Caspase抑制劑也可以用來標記積極凋亡細胞內(nèi)（Grabarek等，2002）。 caspase活化中可檢出多種方式包括免疫印跡，免疫沉淀和免疫組化（圖5B）。兩個多克隆和單克隆抗體procaspases和caspases的積極。凋亡檢測方法需要以酶釋放到細胞裂解液。其次是用熒光檢測的解決方案，具有抗凋亡的微孔的涂層。標記底物。這種方法的caspase活性的檢測通常需要1 105個細胞。該技術允許個人發(fā)起人或執(zhí)行caspases的選擇。它還允許快速和一致的定量細胞凋亡。主要缺點是，樣品的完整性被破壞，從而消除了本地化的可能性內(nèi)組織或確定類型的細胞發(fā)生凋亡的細胞凋亡事件。另一個缺點是，caspase活化不一定表明，細胞凋亡會發(fā)生。此外，還有巨大的重疊成員基板喜好caspase家族，影響了檢測的特異性。凋亡PCR芯片是一個相對較新的方法，采用實時PCR簡介，至少涉及112基因在細胞凋亡（霍夫曼等人，2001。表達。沃雷等，2003年）。這些PCR芯片設計，以確定基因的表達譜編碼的主要配體，受體，細胞內(nèi)調(diào)制器，和轉錄因子的參與程序性細胞死亡的調(diào)控?？沟蛲鲇嘘P的基因也可以評估這種方法。在細胞或組織，可以進行基因表達的比較測試樣品和對照之間。這種檢測類型可以表達的評價為您提供的細胞凋亡和幾家公司的相關基因的重點面板凋亡pathwayspecific基因面板?；虻木垲惙治?，可以揭示不同的時空表達模式轉錄激活和/或鎮(zhèn)壓。然而，對結果的解釋可以混淆的大量分析基因和方法論的復雜性。這種方法使用一個96孔板和低至5毫微克的總RNA。每一個基因，或成績單，標有標記，如熒光染料。一個實時PCR儀用于表達譜。所產(chǎn)生的信號的位置和強度給出了每個樣品全文數(shù)量的估計。芯片測試應結合不同的方法，以確認細胞凋亡。膜改建對細胞凋亡的外質(zhì)膜磷脂殘留的外允許通過一個組織，胚胎或培養(yǎng)的細胞連接蛋白在V（專橫，韋特澤爾和綠色的檢測，2000年）。一旦細胞凋亡與FITC標記的Annexin V的約束，他們可以可視化熒光顯微鏡。的優(yōu)點是靈敏度（可以檢測出單個細胞凋亡）確認引發(fā)caspases的活性和能力。缺點是標記以及壞死細胞的細胞膜。因此，一個關鍵的控制是展示磷脂陽性細胞的細胞膜的完整性。由于膜的損失誠信是一種壞死性細胞死亡的pathognomonic功能，壞死細胞染色與特定膜impermeant如核酸染料碘化丙啶和臺盼藍。同樣，凋亡細胞的細胞膜的完整性可以證明這些染料的排斥。磷脂酰轉移到細胞膜外，也將允許某些染料運輸?shù)揭粋€單向的方式細胞。由于細胞積累染料和體積收縮，細胞染料的內(nèi)容變得更加集中，可以可視化光鏡。這種染料吸收的生物活性，細胞培養(yǎng)工程，沒有標簽壞死細胞，它具有靈敏度高的水平（可以檢測出單個細胞凋亡）。在全掛載檢測細胞凋亡細胞凋亡也可以可視化在整個胚胎或組織使用，如染料坐騎吖啶橙（AO），硫酸耐爾藍（國家統(tǒng)計局），和中性紅（NR）（朱克等，2000）。由于這些染料嗜酸性，他們都集中在高溶酶體的地區(qū)，吞噬活動。結果將需要與其他細胞凋亡的實驗驗證因為這些染料不能區(qū)分細胞凋亡之間的溶酶體降解碎片從退化，如微生物等雜物。雖然所有這些染料的快速和價格便宜，他們有一定的弊端。 AO是毒性和誘變性和淬迅速而國家統(tǒng)計局和NR的標準條件下不穿透厚厚的組織，可能會丟失在準備為切片。 LYSO 追蹤紅是另一種染料，在以類似的方式行為。然而，這種染料可以用激光共聚焦顯微鏡，提供三維成像細胞凋亡。這種染料在加工過程中是穩(wěn)定的，穿透厚厚的組織，是耐淬火。此染料可用于細胞培養(yǎng)以及整個坐騎的胚胎，組織，或器官線粒體分析檢測線粒體細胞色素c釋放，使變化的早期檢測階段的內(nèi)在途徑。激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）創(chuàng)建亞微米薄光片，通過活細胞，可用于監(jiān)測幾個線粒體事件隨著時間的推移（Bedner等人，1999年。 Darzynkiewicz等，1999）的完整的單細胞。線粒體通透性轉換（MPT），內(nèi)線粒體膜的去極化，鈣+通量，線粒體氧化還原狀態(tài)，都可以監(jiān)控與活性氧方法。主要缺點是，線粒體的參數(shù)，這方法顯示器，也可以發(fā)生在壞死。對面的電化學梯度細胞凋亡過程中線粒體外膜（MOM）的崩潰，讓與檢測熒光陽離子染料（Poot和皮爾斯，1999年）。在健康的細胞親脂性染料積聚在線粒體中，形成聚集體，發(fā)出特異性熒光。在細胞凋亡的MOM不保持電化學梯度和陽離子染料擴散進入細胞質(zhì)中，它發(fā)出的熒光是從聚合不同形式。其他線粒體染料，可用于測量氧化還原電位或代謝活性在細胞中的線粒體。然而，這些染料沒有解決細胞死亡的機制應使用與其他細胞凋亡檢測方法，如一個凋亡一起檢測。使用熒光和細胞色素C從線粒體釋放，也可以被檢測生活或固定細胞的電子顯微鏡（Scorrano等，2002）。然而，細胞色素c變得不穩(wěn)定，一旦釋放進入細胞質(zhì)（Goldstein等人，2000年）。因此，一個應使用非凋亡控制，以確保能夠使用的染色條件檢測到任何可用的細胞色素c如B??ax的，出價和Bcl 2凋亡或抗凋亡的調(diào)節(jié)蛋白，也可檢測使用熒光和共聚焦顯微鏡（錢學森，1998年，張等人，2002年）。然而，熒光蛋白標記，可能會改變的天然蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的相互作用。因此，應使用其他細胞凋亡檢測確認結果。其他形式的程序性細胞死亡有證據(jù)表明其他形式的非凋亡程序性細胞死亡，也應考慮，因為它們可能會導致細胞死亡程序進入新的見解，并揭示其潛在的獨特作用，在發(fā)展，動態(tài)平衡，腫瘤和變性。它有越來越明顯，細胞死亡的機制，包括一個高度多樣化的數(shù)組表型和分子機制。而且有證據(jù)表明，某種形式的調(diào)制細胞死亡，可能會導致另一個。由于其他類型的細胞死亡，可能需要基因的激活和功能在能源的依賴性，他們也認為是形式“程序性細胞死亡?！币虼?，有一些阻力的長期獨家使用“程序性細胞死亡”的具體描述凋亡。有壞死樣的表型的要求基因激活和蛋白質(zhì)的合成，使他們，嚴格來說，各種形式的程序性細胞死亡（Proskuryakov等，2003）。這些形式細胞死亡有壞死和凋亡的某些形態(tài)特征已鑒于“aponecrosis”（Formigli等，2000）。通過影響線粒體呼吸與抗霉素A，F(xiàn)ormigli和他的同事鏈，誘導細胞死亡，共享的類型與細胞凋亡和壞死的動態(tài)，分子和形態(tài)學特征。caspase獨立的神經(jīng)細胞死亡的機制也已確定。這特定類型的程序性細胞死亡可能涉及到具體的線粒體因素。在實驗模型，凋亡誘導因子（AIF）和核酸內(nèi)切酶摹促進這種類型的細胞死亡，但是，SMAC / DIABLO和HtrA2/Omi可能也有助于（Ravagnan等。2002年車廁所等，2002年b）。奧本海姆和他的同事（2001）表明，編程發(fā)生在發(fā)展中國家哺乳動物的神經(jīng)元細胞死亡，甚至后的凋亡基因缺失。其他的研究表明，抑制凋亡的執(zhí)行機制，可能只暫時挽救受損神經(jīng)元，經(jīng)典的凋亡特征仍然可以出現(xiàn)在凋亡抑制神經(jīng)元（Volbracht等，2001）。看來，caspase依賴的，caspase獨立的神經(jīng)細胞死亡的機制可能依賴于大腦區(qū)域的細胞類型，和年齡。Sperandio和他的同事（2000）描述了一個程序性細胞死亡的形式，形態(tài)和生化有別于凋亡，被稱為“paraptosis。”雖然這種細胞死亡的形式不應對Caspase抑制劑或BCL XL，它是由一個Caspase 9活性APAF 1獨立的另一種形式。這樣的形式程序性細胞死亡的報道出現(xiàn)在開發(fā)過程中，在轉基因模型亨廷頓氏病和人類肌萎縮性脊髓側索硬化癥（DAL粵語和格尼，1994年。Turmaine等，2000）。有人猜測，“自體吞噬”代表了另一種程序性細胞的機制死亡，和類似的細胞凋亡，發(fā)育過程中，人類疾病中的重要作用營養(yǎng)剝奪的細胞反應（Schwartz等人，1993年。Gozuacik和泡菜，2004年。 Debnath說等，2005）。作為同義詞使用的其它術語“macroautophagy”和“自噬性Ⅱ型細胞死亡”（Klionsky和電子病歷，2000年）。自噬性細胞死亡特點是細胞質(zhì)和細胞器的雙重或multimembrane封存泡和傳送到細胞自身的后續(xù)退化（野田等的溶酶體。2002年）。從某種意義上說，細胞“cannibalizes”本身。自體吞噬的機制和形態(tài)進化與生物之間的強烈的相似之處保守的，多樣的動物一樣，植物和酵母。自體吞噬的過程取決于兩個連續(xù)的蛋白質(zhì)的合成和ATP的持續(xù)存在。的分子機制已被廣泛研究酵母和哺乳動物同源繼續(xù)闡明（Ohsumi，2001年，黃和Klionsky，2002年）。這是一個自噬細胞程序化死亡的區(qū)別，因為它被確定一些細胞會發(fā)生caspase獨立的基因激活的細胞死亡，但會顯示幾個特征（表1）細胞凋亡的超微結構特征，并不會展覽DNA梯狀條帶（科恩，1991年）。然而，這些細胞確實需要從頭基因表達在增加泛素基因，類似的細胞凋亡（Ohsumi的表達，2001年Gozuacik和泡菜，2004年）。具體來說，在所有真核細胞自噬的發(fā)生和涉及封存細胞質(zhì)和亞細胞細胞膜的動態(tài)重排交付退化情況時溶酶體或液泡的細胞器。這被認為是細胞質(zhì)組成部分的一般營業(yè)額的主要誘導途徑。獨特的泛素樣蛋白的共軛體系和一個蛋白復合物，指示溶酶體或液泡膜的對接和融合