企業(yè)營銷策略未來趨勢解析(編輯修改稿)
2025-02-05 19:03 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（ 1） 戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá) 60%70%）和重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（ 2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將 HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效 .原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響 ELISA中最后的酶活性測定。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護(hù)一個低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測定條件和測定費用的節(jié)省。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果 結(jié)合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（ HRP結(jié)合物加硫柳泵， AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果 結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上： %牛血清白蛋白， %吐溫 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在 48℃ 保存期可達(dá) 6個月。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果 酶的底物 HRP的底物OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在 492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是 HRP結(jié)合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和 ABTS 。E原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果TMB經(jīng) HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。 TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與 H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后， TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如 OPD和 TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于 H2O小分醇的過氧化物和尿素過氧化物 (urea peroxide)。 原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對 硝基苯磷酸酯 作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在 405nm波長處有吸收峰。用 NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。 AP也有發(fā)熒光底物（磷酸 4甲基傘酮），可用于 ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果 酶反應(yīng)終止液 常用的 HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果4 對照設(shè)定 陽性對照品 (positive control)和陰性對照品 (negative control)是檢驗試驗有效性的控制品，同時也作為判斷結(jié)果的對照。陽性對照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計標(biāo)本物質(zhì)的量。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果 參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測范圍的 45個濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中 .陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。例如 HBsAg檢測的陰性對照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是陰性。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果5 標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有 纖維蛋白原 和 抗凝劑 外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以 HRP為標(biāo)記的 ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。原理類型試劑準(zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果加樣 : 在 ELISA中一般有 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在 LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马椩眍愋驮噭?zhǔn)備對照標(biāo)本結(jié)果保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育 (incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么 ELISA反應(yīng)總是需要
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