企業(yè)營銷策略未來趨勢(shì)解析-文庫吧
2025-01-08 19:03 本頁面
【正文】 對(duì)照標(biāo)本結(jié)果3. ELISA的試劑 (A、 B、 C三部分 )ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。（ 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（ 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（ 3）酶的底物；（ 4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（ 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（ 6）洗滌液；（ 7）酶反應(yīng)終止液原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果ELISA的試劑準(zhǔn)備 A 固相載體 聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的 ELISA板應(yīng)該是 吸附性能好 ， 空白值低 ， 孔底透明度高 ，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間 性能相近 。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被 (coating)。 蛋白質(zhì) 與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的 疏水基團(tuán) ，故更易吸附到固相載體表面。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果不易吸附 的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的 DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì) 無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可伲瑑H為直接包被的 1/10乃至于 /100。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原 是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在 Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液 .須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 包被的條件pH78的 TrisHCL緩沖液。 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過夜， 37℃ 中保溫 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 封閉封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠。脫脂奶粉 ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（ 5%）。 所有的 ELISA固相均需封閉？原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫 20磷酸鹽緩沖液。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B 結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2抗體（或抗原）的免疫活性 3含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的 IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在 ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在 ELISA中， HRP， AP，葡萄糖氧化酶， βD 半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。原理類型試劑準(zhǔn)備對(duì)照標(biāo)本結(jié)果 結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即
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