【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 片段BAKanMXBB導(dǎo)入黃酒酵母單倍體出發(fā)菌株中，篩選得到BAT1基因敲除突變株，并將BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母單倍體菌株高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。（2）BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段BAKanMXBB導(dǎo)入本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的BAT2基因敲除黃酒酵母單倍體菌株中，篩選得到BATBAT2基因雙敲除突變株，并將BATBAT2基因雙敲除突變株及其單敲除突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母單倍體菌株的高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。（3）HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HAKanMXHB導(dǎo)入黃酒酵母二倍體出發(fā)菌株中，篩選得到HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株與二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究HOM2基因一個(gè)等位基因的敲除對(duì)黃酒酵母二倍體菌株高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。然后，利用Cre/LoxP系統(tǒng)去除HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株中引入的KanMX標(biāo)記基因。（4）HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHB1A1K，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HA1KanMXHB1導(dǎo)入HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株中，篩選得到HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株與HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株及二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究HOM2基因兩個(gè)等位基因的敲除對(duì)黃酒酵母二倍體菌株高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。63天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法 材料與儀器 主要試劑本論文所用實(shí)驗(yàn)試劑如表21所示。表21 實(shí)驗(yàn)試劑Table 21 Reagents used in this work試劑生產(chǎn)廠家葡萄糖天津市化學(xué)試劑一廠蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)公司酵母浸粉北京奧博星生物技術(shù)公司胰蛋白胨天津市化學(xué)試劑一廠氯化鈉天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠無水乙醇天津市江天化工技術(shù)有限公司G418北京索萊寶科技有限公司氨芐霉素上海生工生物有限公司氫氧化鈉天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠濃鹽酸天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠濃硫酸天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠PEG3350北京索萊寶科技有限公司鮭魚精DNA北京索萊寶科技有限公司醋酸鋰天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠Tris平衡酚北京索萊寶科技有限公司氯仿天津化學(xué)試劑有限公司異戊醇天津化學(xué)試劑有限公司硫酸銅天津化學(xué)試劑有限公司次甲基藍(lán)天津化學(xué)試劑有限公司酒石酸鉀鈉天津化學(xué)試劑有限公司亞鐵氰化鉀天津化學(xué)試劑有限公司丙三醇天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠SDS天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠酵母破壁酶北京索萊寶科技有限公司RNaseA北京索萊寶科技有限公司蛋白酶K北京索萊寶科技有限公司LATaqTaKaRa中國大連公司Solution ITaKaRa中國大連公司DL5000 MarkerTaKaRa中國大連公司乙酸正戊酯天津光復(fù)精細(xì)化工研究所正丙醇天津光復(fù)精細(xì)化工研究所異丁醇天津光復(fù)精細(xì)化工研究所異戊醇天津光復(fù)精細(xì)化工研究所 主要實(shí)驗(yàn)儀器 本論文所用實(shí)驗(yàn)儀器如表22所示。表22 實(shí)驗(yàn)儀器Table 22 Instruments and apparatuses used in this work儀器公司電熱恒溫水浴鍋天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司恒溫?fù)u床上海制成儀器制品有限公司生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司電子天平梅特勒托利多儀器有限公司高壓蒸汽滅菌鍋山東新華醫(yī)療器械廠 電熱鼓風(fēng)干燥箱DL102型 天津市實(shí)驗(yàn)器械廠HS1300V型超凈臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司臺(tái)式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠GL20A型高速冷凍離心機(jī)中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司722型光度分光光度計(jì)天津市普瑞斯儀器有限公司pHSJ4A型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)上?？茖W(xué)儀器有限公司P型移液器法國吉爾森公司PCT200型PCR基因擴(kuò)增儀美國BIORAD公司DYY4c型電泳儀北京市六一儀器廠全自動(dòng)凝膠成像儀美國SYNGENE公司7890A 氣象色譜儀北京安捷倫科技有限公司 菌種與質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)中所使用的黃酒酵母菌株、大腸桿菌菌株和質(zhì)粒載體如表23所示：表23本實(shí)驗(yàn)所使用菌株和質(zhì)粒的性質(zhì)及來源Table 23 Strains and plasmids used in this study菌株或質(zhì)粒背景介紹來源菌株（Strains）RY1工業(yè)用黃酒酵母二倍體天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1a1MATa，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1α3MATα，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1a1?bat2MATa ?bat2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1α3?bat2MATα ?bat2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY11MATa/MATα ?hom2::kan本研究RY12MATa/MATα ?hom2本研究RY13MATa/MATα ?hom2/?hom2::kan本研究RY1a1?bat1MATa ?bat1::kan本研究RY1α3?bat1MATα ?bat1::kan本研究RY1a1?bat1?bat2MATa ?bat2?bat1::kan本研究RY1α3?bat1?bat2MATα ?bat2?bat1::kan本研究質(zhì)粒（Plasmids）pUC19Ampr，克隆載體天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pUG6攜帶KanMX抗性基因天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pGAPza攜帶Zeocin抗性基因天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pUCBABKAmpr，敲除BAT1基因的重組質(zhì)粒本研究pUCHABKAmpr，敲除HOM2基因的重組質(zhì)粒本研究pUCHB1A1KAmpr，敲除HOM2基因的重組質(zhì)粒本研究 主要培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基（w/v）胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，%，蒸餾水配制，pH ，115℃、 min。（2）YEPD培養(yǎng)基（w/v）葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。（3）半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基半乳糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。（4）麥汁培養(yǎng)基稱取一定量粉碎的麥芽，按1：5的料水比于65℃水浴鍋中糖化34 h至碘檢完畢，然后經(jīng)過過濾、煮沸、過濾，并用糖度計(jì)調(diào)整外觀糖度至13176。Brix，115℃、 min。（5）黃酒發(fā)酵培養(yǎng)基500 mL三角瓶中加入100 g大米（蒸熟并攤涼），10 g麥曲，45 mL米漿水（PH ），60 mL清水，30 mL二級(jí)種子液。以上前四種培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需再加2%的瓊脂。 主要溶液（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取經(jīng)過105℃ g，然后用蒸餾水溶解，再加入5 mL的濃鹽酸，最終用蒸餾水定容至1 L。（2）斐林甲液分別稱取15 g五水硫酸銅， g次甲基藍(lán)，用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（3）斐林乙液分別稱取50 g酒石酸鉀鈉，54 g氫氧化鈉，以及4 g亞鐵氰化鉀，用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（4）100 mg/mL氨芐青霉素溶液稱取10 g氨芐青霉素，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。（5）G418 溶液稱取10 g G418，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL，得到濃度為100 mg/mL的母液， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。（6）酚氯仿溶液按照25：24：1的體積比分別量取Tris飽和酚、氯仿、異戊醇，然后混合均勻，存放于棕色瓶內(nèi)，并4℃保存。（7）50TAE緩沖液分別取242 gTris， mL冰醋酸，和100 mL mol/L的Na2EDTA（pH ），然后用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（8）1 mol/L醋酸鋰 g醋酸鋰，然后用蒸餾水定容至100 mL，最后再過濾除菌。（9）PEG3350（50％，w/v）稱取25 g PEG3350，然后用蒸餾水定容至50 mL，115℃滅菌15 min。（10）60%乙醇溶液量取60 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。（11）20%乙醇溶液量取20 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。（12）高級(jí)醇混標(biāo)溶液分別準(zhǔn)確量取色譜純的正丙醇、 mL、 mL mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 mL，得到高級(jí)醇的混標(biāo)母液，4℃冷藏。（13）%內(nèi)標(biāo)液 mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 %（V/V）的內(nèi)標(biāo)液，4℃冷藏。 分析方法 CO2失重的測(cè)定黃酒發(fā)酵時(shí)，用帶有針孔的橡皮塞塞緊瓶口，置于30℃條件下靜置發(fā)酵，在黃酒發(fā)酵過程中每隔12 h稱重一次，稱重前充分晃動(dòng)三角瓶中的發(fā)酵液以盡可能趕走瓶中CO2, 當(dāng)發(fā)酵失重小于1 g/12 h時(shí)，表明黃酒發(fā)酵已經(jīng)基本結(jié)束。 酒精度的測(cè)定利用酒精計(jì)比重法測(cè)定酒精度[74]。用100 mL的量筒量取100 mL發(fā)酵液于1000 mL的蒸餾瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，再加入適量的消泡劑，搖勻，接入蒸餾裝置，并用100 mL量筒作為接收器收集蒸餾液。同時(shí)為了防止酒精揮發(fā)，在蒸餾過程中應(yīng)使量筒始終處于冰浴中。當(dāng)量筒中蒸餾液滴至98 mL左右時(shí)停止蒸餾，然后再用蒸餾水補(bǔ)足至100 mL即可。蒸餾結(jié)束后用酒精計(jì)測(cè)定蒸餾液酒精度，同時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量蒸餾液的溫度，最后將該溫度下測(cè)定的酒精度換算成20℃條件下的酒精度。 還原糖的測(cè)定[75]利用斐林試劑法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量。（1）原理以次甲基藍(lán)作為指示劑，用試液滴定煮沸著的斐林試劑，終點(diǎn)時(shí)微過量糖液會(huì)將藍(lán)色的指示劑次甲基藍(lán)還原成無色的還原態(tài)，最后根據(jù)試液的用量可以求得還原糖的含量。（2）斐林試劑的標(biāo)定分別吸取斐林試劑甲液和乙液各5 mL，并置于150 mL三角瓶中，然后準(zhǔn)確地加入10 mL空白液（蒸餾水），%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液是在1 mL以內(nèi)，搖勻。在電爐上加熱至沸騰，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定直至藍(lán)色消失，此滴定操作過程要求操作準(zhǔn)確并且迅速，需要在1 min以內(nèi)完成，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積。（3）測(cè)定吸取斐林甲液、乙溶液各5 mL于150 mL的三角瓶中，然后加入1mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的樣品稀釋液以及9 mL蒸餾水，其余操作過程同上。（4）計(jì)算式中：Vo—空白液所消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積（mL）；V—樣品稀釋液所消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積（mL）；C—標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度（g/L）n—樣品的稀釋倍數(shù)Vs—所取樣品稀釋液的體積（mL） 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定采用氣相色譜法[7577]測(cè)定黃酒發(fā)酵液的蒸餾液中高級(jí)醇含量，采用的是內(nèi)標(biāo)法，乙酸正戊酯作為內(nèi)標(biāo)。（1）色譜條件氣相色譜儀為Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 30 m320 μm μm ，檢測(cè)器為FID。進(jìn)樣口的溫度為 220℃，檢測(cè)器的溫度為250℃。進(jìn)樣量條件：1 μL的進(jìn)樣量，并設(shè)置為20：1的分流比。載氣條件：載氣為高純氮，并將其流速設(shè)置為2 mL/min。升溫程序：起始柱溫設(shè)置為50℃，并以5℃ /min的升溫速度上升至80℃，然后再以10℃/min升溫升至150℃。（2）樣品預(yù)處理 mL至10 mL容量瓶中，并用發(fā)酵液蒸餾所得酒樣定容，混勻后， mL加入到自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，然后進(jìn)行氣相分析。（3）分析方法保留時(shí)間法為氣相色譜定性鑒定中最常用的分析方法，在一定的色譜條件下，各物質(zhì)的出峰時(shí)間保持不變。先進(jìn)樣需要檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，可測(cè)得各物質(zhì)的保留時(shí)間。然后再進(jìn)酒樣進(jìn)行檢測(cè)，就可以根據(jù)各物質(zhì)的保留時(shí)間初步定性酒樣中需要檢測(cè)的各物質(zhì)。根據(jù)各物質(zhì)的峰面積用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)一步定量計(jì)算各物質(zhì)的含量。 生長曲線的測(cè)定（1）取斜面菌種一環(huán)接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃條件下靜置培養(yǎng)12 h。（2）用全自動(dòng)生長曲線分析儀測(cè)定菌株的生長曲線：接種量為2%～5%梯度接種，培養(yǎng)溫度為30℃，600 nm紫外光下測(cè)定吸光值，每隔1 h測(cè)定一次菌液的OD值。（3）以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線。 實(shí)驗(yàn)方法 引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)中所用全部引物序列見表24。（1）BAT1基因單敲除突變株及BATBAT2基因雙敲除突變株的構(gòu)建及驗(yàn)證所需引物根據(jù)GenBank報(bào)道的BAT1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物BAT1U和BAT1D，用于驗(yàn)證黃酒酵母基因組中BAT1基因的存在。在BAT1基因外部的上下游分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物BAU和BAD及BBU和BBD，分別擴(kuò)增BAT1基因兩側(cè)非編碼區(qū)的片段BA和BB，用于同源重組敲除BAT1基因。根據(jù)質(zhì)粒pUG6序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物KU和KD擴(kuò)增KanMX基因，作為抗性篩選標(biāo)記。在BA片段的上游設(shè)計(jì)引物BS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計(jì)引物KSBAT1用于BAT1基因單敲除突變株的上游驗(yàn)證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計(jì)