【正文】 in，并快速在冰上冷卻。 酵母轉(zhuǎn)化酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[7879]的主要操作步驟如下：（1）酵母感受態(tài)的制備1）取斜面酵母菌種一環(huán)于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。 酶切載體的去磷酸化選用牛小腸堿性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）對(duì)酶切回收后的載體進(jìn)行去磷酸化處理，如表28，去磷酸化體系按照60 μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行。9） 將吸附柱置于新的離心管中，并向吸附膜中央懸空滴加50～200 μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，于室溫下放置5 min，然后12000 rpm離心1 min。5）將上一步離心得到的上清液轉(zhuǎn)入吸附柱中，并在室溫下放置2 min，12000 rpm離心1 min之后，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進(jìn)收集管中。1） mL的EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清。3）棄除上清，剩余大約50 μL液體，用移液槍吹打混勻菌體。4）加入適量的經(jīng)37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)1 h，5）取適量菌液涂布含Amp+抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜。放置于70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）然后向大腸桿菌菌體沉淀中加入20 mL冰浴的Solution A，輕輕晃動(dòng)以懸浮菌體沉淀，禁止劇烈振蕩。 （8）12000 rpm離心1 min，離心管內(nèi)的溶液即為純化的DNA溶液，20℃保存 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備采用TAKARA的Competent Cell Preparation Kit制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：1）取70℃保存的大腸桿菌DH5α在LB平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。 （4）向離心管中加入700 μL DNA Wash Buffer，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，此操作重復(fù)兩次。 PCR產(chǎn)物純化回收采用OMEGA公司的DNA Back純化回收試劑盒進(jìn)行PCR、酶切反應(yīng)后的純化回收。（4）向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液并使其液面高出膠面1 mm左右。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。表25 PCR反應(yīng)體系Table 25 PCR reaction system成分加樣量10LA Taq Buffer 2 μLdNTPs ( mmol/L) μL上游引物(10 181。（10）12000 rpm離心2 min，將吸附柱敞口放置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，其目的是將吸附柱中殘留的漂洗液除去，否則殘留漂洗液中的乙醇會(huì)影響到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，如酶切、PCR等。（6）消化完全后加入200 μL溶液B，200 μL無水乙醇，并充分地顛倒混勻，這時(shí)可能有絮狀沉淀產(chǎn)生，并不影響DNA的提?。梢詫⑷芤号c絮狀沉淀都加入到吸附柱中，然后室溫放置2 min，最好能充分混勻以減少沉淀）。（2）取適量酵母菌液（不超過5107 cells） mL EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清；向菌體中加入470 μL山梨醇Buffer，充分懸浮酵母菌體，再加入25 μL酵母破壁酶及5 μL β巰基乙醇，上下顛倒充分混勻，30℃溫度下放置1~2 h。（3）HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株RY13的構(gòu)建及驗(yàn)證所需引物在HOM2基因保守區(qū)的兩端分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物HA1U和HA1D及HB1U和HB1D，分別擴(kuò)增HOM2基因的部分片段（分別命名為HA1片段和HB1片段），用于同源重組中斷HOM2基因。BATBAT2基因雙敲除突變株的驗(yàn)證和BAT1基因單敲除突變株的驗(yàn)證相同。（1）BAT1基因單敲除突變株及BATBAT2基因雙敲除突變株的構(gòu)建及驗(yàn)證所需引物根據(jù)GenBank報(bào)道的BAT1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物BAT1U和BAT1D，用于驗(yàn)證黃酒酵母基因組中BAT1基因的存在。 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（1）取斜面菌種一環(huán)接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃條件下靜置培養(yǎng)12 h。（3）分析方法保留時(shí)間法為氣相色譜定性鑒定中最常用的分析方法，在一定的色譜條件下，各物質(zhì)的出峰時(shí)間保持不變。進(jìn)樣量條件：1 μL的進(jìn)樣量，并設(shè)置為20：1的分流比。（3）測(cè)定吸取斐林甲液、乙溶液各5 mL于150 mL的三角瓶中，然后加入1mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的樣品稀釋液以及9 mL蒸餾水，其余操作過程同上。 還原糖的測(cè)定[75]利用斐林試劑法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量。用100 mL的量筒量取100 mL發(fā)酵液于1000 mL的蒸餾瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，再加入適量的消泡劑，搖勻，接入蒸餾裝置，并用100 mL量筒作為接收器收集蒸餾液。（12）高級(jí)醇混標(biāo)溶液分別準(zhǔn)確量取色譜純的正丙醇、 mL、 mL mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 mL，得到高級(jí)醇的混標(biāo)母液，4℃冷藏。（8）1 mol/L醋酸鋰 g醋酸鋰，然后用蒸餾水定容至100 mL，最后再過濾除菌。（4）100 mg/mL氨芐青霉素溶液稱取10 g氨芐青霉素，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。以上前四種培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需再加2%的瓊脂。（3）半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基半乳糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。63天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法 材料與儀器 主要試劑本論文所用實(shí)驗(yàn)試劑如表21所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HAKanMXHB導(dǎo)入黃酒酵母二倍體出發(fā)菌株中，篩選得到HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株與二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究HOM2基因一個(gè)等位基因的敲除對(duì)黃酒酵母二倍體菌株高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段BAKanMXBB導(dǎo)入黃酒酵母單倍體出發(fā)菌株中，篩選得到BAT1基因敲除突變株，并將BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母單倍體菌株高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)過程中，郝欣等人構(gòu)建了BAT2基因敲除突變株，該突變株進(jìn)行酒精濃醪發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，突變株的基本發(fā)酵性能與出發(fā)菌株基本相同，產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了55%和34%；戴龍海等人構(gòu)建了BAT2基因敲除單倍體菌株，該突變株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，突變株產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了37%和12%左右，同時(shí)，敲除BAT2基因?qū)S酒酵母菌株的基本發(fā)酵性能無明顯影響。因此降低黃酒中高級(jí)醇含量適應(yīng)健康、安全、衛(wèi)生的消費(fèi)趨勢(shì)。 本課題的立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容黃酒是我國(guó)的民族特產(chǎn)，深受廣大人民群眾的喜愛。Dickenson[6769]等人研究發(fā)現(xiàn)，由YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶是α酮基異己酸分解形成異戊醇的關(guān)鍵酶，構(gòu)建YDL080C基因缺失的突變株，能夠阻斷或者減弱α酮基異己酸轉(zhuǎn)化形成異戊醇的途徑，從而降低異戊醇的生成量。Yoshimoto[63]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變株發(fā)酵生成異丁醇和異戊醇的產(chǎn)量分別降低了72%和40%。 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶對(duì)高級(jí)醇生成量的影響Col243。細(xì)胞融合育種存在過程比較繁瑣且得到的目的菌株后代會(huì)出現(xiàn)性狀分離等缺點(diǎn)，因而限制了該技術(shù)在工業(yè)育種方面的應(yīng)用。其次，進(jìn)行誘變后需要大量處理供試菌株，而且誘變育種的方式由于誘發(fā)突變的盲目性大、難以掌握方向，所以篩選到的目的菌株很少，同時(shí)也很難將不同目的性狀集中到同一株菌，另外，篩選得到的目的菌株也容易發(fā)生回復(fù)突變。趙樹欣[57]等人利用離子注入與紫外誘變經(jīng)二重誘變篩選得到的突變株，%。在Ehrlich代謝途徑中，氨基酸分解生成相應(yīng)的高級(jí)醇的反應(yīng)過程，是由酵母細(xì)胞中的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、酮酸脫羧酶、脫氫酶等酶的催化活性決定的。 低產(chǎn)高級(jí)醇酵母菌株的研究進(jìn)展在酵母發(fā)酵過程中，可以通過優(yōu)化釀酒工藝來控制高級(jí)醇的生成，而基于代謝控制理論，通過影響或者改變酵母菌株的代謝途徑，從根本上降低高級(jí)醇的生成，不但可以降低生產(chǎn)成本，還能提高黃酒的品質(zhì)。 黃酒后處理工藝控制高級(jí)醇含量根據(jù)高級(jí)醇的理化性質(zhì)，可以通過以下方法降低半成品黃酒中的高級(jí)醇含量。以較低溫度浸漬較長(zhǎng)時(shí)間，以使原料中的部分蛋白質(zhì)因分解而被除去。 除了以上因素，很多文獻(xiàn)中也表明離子水平、pH值等因素也會(huì)對(duì)發(fā)酵醪中微生物的代謝產(chǎn)生一定的影響，從而進(jìn)一步地影響高級(jí)醇的生成量。當(dāng)發(fā)酵醪中糖化能力不能滿足酵母所需時(shí)，為加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使發(fā)酵醪中糖化力與酵母的發(fā)酵力達(dá)到平衡，這樣就加快了酵母的發(fā)酵速度。 溶氧酵母菌屬于兼性厭氧微生物，在有氧條件和無氧條件下均可以生長(zhǎng)。 發(fā)酵溫度在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度是酵母菌參與生化反應(yīng)的非常重要的外界因素。黃酒發(fā)酵起始時(shí)，酵母菌合成的酮酸量能正好滿足合成氨基酸的需要，所以發(fā)酵醪中沒有過量的酮酸，但是隨著發(fā)酵進(jìn)行，由于酵母菌會(huì)放慢或者停止合成氨基酸，所以發(fā)酵醪液中就會(huì)產(chǎn)生過量的酮酸，而酵母菌無法承受過量酮酸的積累，所以就會(huì)通過合成代謝途徑將過量的酮酸轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇。因此發(fā)酵醪中的碳氮比控制在能滿足酵母菌的需要的范圍內(nèi)，這樣能夠防止生成過多的高級(jí)醇。黃酒釀造過程中的微生物數(shù)量多且種類廣，除了酵母菌，還包括細(xì)菌、霉菌等，這些微生物死亡后自溶于發(fā)酵醪液中，也會(huì)提供豐富的蛋白質(zhì)[44]。此后的研究中，正丙醇、異戊醇和活性戊醇的合成代謝途徑也陸續(xù)被提出并最終得到證明，總的反應(yīng)途徑如圖13所示。表13 氨基酸代謝產(chǎn)物與其相應(yīng)的高級(jí)醇Table 13 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol氨基酸α酮酸高級(jí)醇亮氨酸α異己酸異戊醇異亮氨酸α酮基β甲基戊酸活性戊醇纈氨酸α酮基異戊酸異丁醇蘇氨酸α酮基丁酸丙醇苯丙氨酸3苯基2酮基丙酸苯丙醇 合成代謝途徑（Harris途徑）經(jīng)過進(jìn)一步研究得知，氨基酸分解代謝途徑并不是高級(jí)醇生成的唯一途徑，主要依據(jù)可以歸納為以下幾點(diǎn)：（1）在合成培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí)，培養(yǎng)基中加入的氨基酸種類與生成的高級(jí)醇種類不具有相關(guān)性；（2）高級(jí)醇的生成速率與乙醇的形成速率相平行，與培養(yǎng)基中氨基酸含量的高低無關(guān)；（3）酵母在含有單一氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，仍能形成各種高級(jí)醇；（4）高級(jí)醇中的某些組成（如正丁醇，其相應(yīng)的氨基酸為纈氨酸）在自然界中并不存在。隨后，Lampitt[30]，Yamada[31]，Thorne[3233]，Ingraham[34]等進(jìn)一步研究證實(shí)氨基酸的分解代謝生成各種高級(jí)醇。 黃酒發(fā)酵過程中高級(jí)醇的形成與控制 高級(jí)醇的形成機(jī)理研究表明，在釀酒過程的主發(fā)酵期間，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖伴隨著高級(jí)醇的生成，80%的高級(jí)醇是在這段時(shí)間逐漸形成的[21]，酵母生成高級(jí)醇的代謝途徑有兩個(gè)(圖11)：一是分解代謝途徑即Ehrlich途徑，由氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑生成α酮酸[2223]，α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級(jí)醇；二是糖代謝途徑即Harris途徑，由葡萄糖經(jīng)過EMP途徑以及TCA循環(huán)生成α酮酸[2425],α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級(jí)醇。 表12 黃酒中主要酯類及其顯味特征Table 12 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯類顯味特征乙酸乙酯香蕉、蘋果香，味辣帶澀，味淡乳酸乙酯香氣弱，味微苦，適量有濃厚感，多則帶澀辛酸乙酯似梨香、菠蘿香，蘋果味帶甜己酸乙酯似菠蘿香，味甜爽口，大曲酒香，有愉快氣味乙酸異戊酯梨香，香蕉油香，蘋果味琥珀酸二乙酯微弱并令人愉快的香氣 其他類物質(zhì)對(duì)黃酒風(fēng)味的影響黃酒中的酸是黃酒風(fēng)味中重要的呈味物質(zhì)，含酸量過低，味淡，酒體不協(xié)調(diào)；含酸量過高，會(huì)影響酒體的整體風(fēng)味。表11 黃酒中主要高級(jí)醇及其顯味特征Table 11 Main higher alcohols in yellow rice wine and their characteristics of flavor 高級(jí)醇顯味特征正丙醇刺激的酒精味，似醚臭，有苦味正丁醇較強(qiáng)的乙醇味和微弱的清香感異丁醇有微弱的戊醇味，有苦味感異戊醇雜醇油味，刺舌頭，稍澀，有香蕉味苯乙醇似玫瑰香味，微帶苦澀 酯類對(duì)黃酒風(fēng)味的影響酯類物質(zhì)是黃酒中又一重要的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)黃酒的風(fēng)味和品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，通常具有很強(qiáng)的水果味或花香味。尤其是異戊醇含量過高時(shí)，由于造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血，而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀。高級(jí)醇的種類和含量對(duì)黃酒的口感、品質(zhì)有很大的影響，黃酒中所含有的主要高級(jí)醇及其風(fēng)味特征見表11。其中，高級(jí)醇和酯類是黃酒中最重要的兩類風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)黃酒酒體豐滿、濃厚，并增加酒的協(xié)調(diào)性起著重要作用。如何運(yùn)用研究成果來不斷改進(jìn)黃酒的傳統(tǒng)釀造工藝技術(shù)，如何利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)向生產(chǎn)者和消費(fèi)者客觀科學(xué)的介紹黃酒的風(fēng)味物質(zhì)，以及進(jìn)一步的改善黃酒的口感和風(fēng)味，達(dá)到吸引更多的消費(fèi)者等，已經(jīng)成為黃酒行業(yè)發(fā)展中重點(diǎn)研究的當(dāng)務(wù)之急。2013年18月，全國(guó)規(guī)模以上的黃酒企業(yè)銷售額同比增加8%，利潤(rùn)增加19%左右，較其他酒種相對(duì)穩(wěn)定。近年來，由于國(guó)家政策的支持、黃酒企業(yè)積極引導(dǎo)人們消費(fèi)，從而黃酒行業(yè)的發(fā)展勢(shì)頭良好，且行業(yè)的整體規(guī)模也穩(wěn)步擴(kuò)大。黃酒除了直接飲用外，還可以入藥，也可以入饌來去腥增香。黃酒是以谷物為主要原料釀制成的糧食酒，它不同于白酒，黃酒是沒有經(jīng)過蒸餾的，酒精含量較低。黃酒由于具有悠久的歷史、豐富的營(yíng)養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味、酒精度低等特點(diǎn)[2]，所以受到廣大人民群眾的喜愛。黃酒中還含有