【正文】 in，并快速在冰上冷卻。 酵母轉(zhuǎn)化酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[7879]的主要操作步驟如下：（1）酵母感受態(tài)的制備1）取斜面酵母菌種一環(huán)于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。 酶切載體的去磷酸化選用牛小腸堿性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）對酶切回收后的載體進(jìn)行去磷酸化處理，如表28，去磷酸化體系按照60 μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行。9） 將吸附柱置于新的離心管中，并向吸附膜中央懸空滴加50～200 μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，于室溫下放置5 min，然后12000 rpm離心1 min。5）將上一步離心得到的上清液轉(zhuǎn)入吸附柱中，并在室溫下放置2 min，12000 rpm離心1 min之后，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進(jìn)收集管中。1） mL的EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清。3）棄除上清，剩余大約50 μL液體，用移液槍吹打混勻菌體。4）加入適量的經(jīng)37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)1 h，5）取適量菌液涂布含Amp+抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜。放置于70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）然后向大腸桿菌菌體沉淀中加入20 mL冰浴的Solution A，輕輕晃動以懸浮菌體沉淀，禁止劇烈振蕩。 （8）12000 rpm離心1 min，離心管內(nèi)的溶液即為純化的DNA溶液，20℃保存 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備采用TAKARA的Competent Cell Preparation Kit制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：1）取70℃保存的大腸桿菌DH5α在LB平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。 （4）向離心管中加入700 μL DNA Wash Buffer，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，此操作重復(fù)兩次。 PCR產(chǎn)物純化回收采用OMEGA公司的DNA Back純化回收試劑盒進(jìn)行PCR、酶切反應(yīng)后的純化回收。（4）向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液并使其液面高出膠面1 mm左右。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證。表25 PCR反應(yīng)體系Table 25 PCR reaction system成分加樣量10LA Taq Buffer 2 μLdNTPs ( mmol/L) μL上游引物(10 181。（10）12000 rpm離心2 min，將吸附柱敞口放置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，其目的是將吸附柱中殘留的漂洗液除去，否則殘留漂洗液中的乙醇會影響到后續(xù)的實驗，如酶切、PCR等。（6）消化完全后加入200 μL溶液B，200 μL無水乙醇，并充分地顛倒混勻，這時可能有絮狀沉淀產(chǎn)生，并不影響DNA的提?。梢詫⑷芤号c絮狀沉淀都加入到吸附柱中，然后室溫放置2 min，最好能充分混勻以減少沉淀）。（2）取適量酵母菌液（不超過5107 cells） mL EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清；向菌體中加入470 μL山梨醇Buffer，充分懸浮酵母菌體，再加入25 μL酵母破壁酶及5 μL β巰基乙醇，上下顛倒充分混勻，30℃溫度下放置1~2 h。（3）HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株RY13的構(gòu)建及驗證所需引物在HOM2基因保守區(qū)的兩端分別設(shè)計一對引物HA1U和HA1D及HB1U和HB1D，分別擴增HOM2基因的部分片段（分別命名為HA1片段和HB1片段），用于同源重組中斷HOM2基因。BATBAT2基因雙敲除突變株的驗證和BAT1基因單敲除突變株的驗證相同。（1）BAT1基因單敲除突變株及BATBAT2基因雙敲除突變株的構(gòu)建及驗證所需引物根據(jù)GenBank報道的BAT1基因序列設(shè)計一對引物BAT1U和BAT1D，用于驗證黃酒酵母基因組中BAT1基因的存在。 生長曲線的測定（1）取斜面菌種一環(huán)接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃條件下靜置培養(yǎng)12 h。（3）分析方法保留時間法為氣相色譜定性鑒定中最常用的分析方法，在一定的色譜條件下，各物質(zhì)的出峰時間保持不變。進(jìn)樣量條件：1 μL的進(jìn)樣量，并設(shè)置為20：1的分流比。（3）測定吸取斐林甲液、乙溶液各5 mL于150 mL的三角瓶中，然后加入1mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的樣品稀釋液以及9 mL蒸餾水，其余操作過程同上。 還原糖的測定[75]利用斐林試劑法測定發(fā)酵液中還原糖的含量。用100 mL的量筒量取100 mL發(fā)酵液于1000 mL的蒸餾瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，再加入適量的消泡劑，搖勻，接入蒸餾裝置，并用100 mL量筒作為接收器收集蒸餾液。（12）高級醇混標(biāo)溶液分別準(zhǔn)確量取色譜純的正丙醇、 mL、 mL mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 mL，得到高級醇的混標(biāo)母液，4℃冷藏。（8）1 mol/L醋酸鋰 g醋酸鋰，然后用蒸餾水定容至100 mL，最后再過濾除菌。（4）100 mg/mL氨芐青霉素溶液稱取10 g氨芐青霉素，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。以上前四種培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需再加2%的瓊脂。（3）半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基半乳糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。63天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文2 材料與方法 材料與儀器 主要試劑本論文所用實驗試劑如表21所示。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HAKanMXHB導(dǎo)入黃酒酵母二倍體出發(fā)菌株中，篩選得到HOM2基因一個等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因一個等位基因敲除的突變株與二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗，研究HOM2基因一個等位基因的敲除對黃酒酵母二倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段BAKanMXBB導(dǎo)入黃酒酵母單倍體出發(fā)菌株中，篩選得到BAT1基因敲除突變株，并將BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗，研究BAT1基因敲除對黃酒酵母單倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。本實驗室前期實驗過程中，郝欣等人構(gòu)建了BAT2基因敲除突變株，該突變株進(jìn)行酒精濃醪發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，突變株的基本發(fā)酵性能與出發(fā)菌株基本相同，產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了55%和34%；戴龍海等人構(gòu)建了BAT2基因敲除單倍體菌株，該突變株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，突變株產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了37%和12%左右，同時，敲除BAT2基因?qū)S酒酵母菌株的基本發(fā)酵性能無明顯影響。因此降低黃酒中高級醇含量適應(yīng)健康、安全、衛(wèi)生的消費趨勢。 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容黃酒是我國的民族特產(chǎn)，深受廣大人民群眾的喜愛。Dickenson[6769]等人研究發(fā)現(xiàn)，由YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶是α酮基異己酸分解形成異戊醇的關(guān)鍵酶，構(gòu)建YDL080C基因缺失的突變株，能夠阻斷或者減弱α酮基異己酸轉(zhuǎn)化形成異戊醇的途徑，從而降低異戊醇的生成量。Yoshimoto[63]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變株發(fā)酵生成異丁醇和異戊醇的產(chǎn)量分別降低了72%和40%。 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶對高級醇生成量的影響Col243。細(xì)胞融合育種存在過程比較繁瑣且得到的目的菌株后代會出現(xiàn)性狀分離等缺點，因而限制了該技術(shù)在工業(yè)育種方面的應(yīng)用。其次，進(jìn)行誘變后需要大量處理供試菌株，而且誘變育種的方式由于誘發(fā)突變的盲目性大、難以掌握方向，所以篩選到的目的菌株很少，同時也很難將不同目的性狀集中到同一株菌，另外，篩選得到的目的菌株也容易發(fā)生回復(fù)突變。趙樹欣[57]等人利用離子注入與紫外誘變經(jīng)二重誘變篩選得到的突變株，%。在Ehrlich代謝途徑中，氨基酸分解生成相應(yīng)的高級醇的反應(yīng)過程，是由酵母細(xì)胞中的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、酮酸脫羧酶、脫氫酶等酶的催化活性決定的。 低產(chǎn)高級醇酵母菌株的研究進(jìn)展在酵母發(fā)酵過程中，可以通過優(yōu)化釀酒工藝來控制高級醇的生成，而基于代謝控制理論，通過影響或者改變酵母菌株的代謝途徑，從根本上降低高級醇的生成，不但可以降低生產(chǎn)成本，還能提高黃酒的品質(zhì)。 黃酒后處理工藝控制高級醇含量根據(jù)高級醇的理化性質(zhì)，可以通過以下方法降低半成品黃酒中的高級醇含量。以較低溫度浸漬較長時間，以使原料中的部分蛋白質(zhì)因分解而被除去。 除了以上因素，很多文獻(xiàn)中也表明離子水平、pH值等因素也會對發(fā)酵醪中微生物的代謝產(chǎn)生一定的影響，從而進(jìn)一步地影響高級醇的生成量。當(dāng)發(fā)酵醪中糖化能力不能滿足酵母所需時，為加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使發(fā)酵醪中糖化力與酵母的發(fā)酵力達(dá)到平衡，這樣就加快了酵母的發(fā)酵速度。 溶氧酵母菌屬于兼性厭氧微生物，在有氧條件和無氧條件下均可以生長。 發(fā)酵溫度在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度是酵母菌參與生化反應(yīng)的非常重要的外界因素。黃酒發(fā)酵起始時，酵母菌合成的酮酸量能正好滿足合成氨基酸的需要，所以發(fā)酵醪中沒有過量的酮酸，但是隨著發(fā)酵進(jìn)行，由于酵母菌會放慢或者停止合成氨基酸，所以發(fā)酵醪液中就會產(chǎn)生過量的酮酸，而酵母菌無法承受過量酮酸的積累，所以就會通過合成代謝途徑將過量的酮酸轉(zhuǎn)化為高級醇。因此發(fā)酵醪中的碳氮比控制在能滿足酵母菌的需要的范圍內(nèi)，這樣能夠防止生成過多的高級醇。黃酒釀造過程中的微生物數(shù)量多且種類廣，除了酵母菌，還包括細(xì)菌、霉菌等，這些微生物死亡后自溶于發(fā)酵醪液中，也會提供豐富的蛋白質(zhì)[44]。此后的研究中，正丙醇、異戊醇和活性戊醇的合成代謝途徑也陸續(xù)被提出并最終得到證明，總的反應(yīng)途徑如圖13所示。表13 氨基酸代謝產(chǎn)物與其相應(yīng)的高級醇Table 13 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol氨基酸α酮酸高級醇亮氨酸α異己酸異戊醇異亮氨酸α酮基β甲基戊酸活性戊醇纈氨酸α酮基異戊酸異丁醇蘇氨酸α酮基丁酸丙醇苯丙氨酸3苯基2酮基丙酸苯丙醇 合成代謝途徑（Harris途徑）經(jīng)過進(jìn)一步研究得知，氨基酸分解代謝途徑并不是高級醇生成的唯一途徑，主要依據(jù)可以歸納為以下幾點：（1）在合成培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵時，培養(yǎng)基中加入的氨基酸種類與生成的高級醇種類不具有相關(guān)性；（2）高級醇的生成速率與乙醇的形成速率相平行，與培養(yǎng)基中氨基酸含量的高低無關(guān)；（3）酵母在含有單一氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時，仍能形成各種高級醇；（4）高級醇中的某些組成（如正丁醇，其相應(yīng)的氨基酸為纈氨酸）在自然界中并不存在。隨后，Lampitt[30]，Yamada[31]，Thorne[3233]，Ingraham[34]等進(jìn)一步研究證實氨基酸的分解代謝生成各種高級醇。 黃酒發(fā)酵過程中高級醇的形成與控制 高級醇的形成機理研究表明，在釀酒過程的主發(fā)酵期間，酵母菌的生長繁殖伴隨著高級醇的生成，80%的高級醇是在這段時間逐漸形成的[21]，酵母生成高級醇的代謝途徑有兩個(圖11)：一是分解代謝途徑即Ehrlich途徑，由氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑生成α酮酸[2223]，α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級醇；二是糖代謝途徑即Harris途徑，由葡萄糖經(jīng)過EMP途徑以及TCA循環(huán)生成α酮酸[2425],α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級醇。 表12 黃酒中主要酯類及其顯味特征Table 12 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯類顯味特征乙酸乙酯香蕉、蘋果香，味辣帶澀，味淡乳酸乙酯香氣弱，味微苦，適量有濃厚感，多則帶澀辛酸乙酯似梨香、菠蘿香，蘋果味帶甜己酸乙酯似菠蘿香，味甜爽口，大曲酒香，有愉快氣味乙酸異戊酯梨香，香蕉油香，蘋果味琥珀酸二乙酯微弱并令人愉快的香氣 其他類物質(zhì)對黃酒風(fēng)味的影響黃酒中的酸是黃酒風(fēng)味中重要的呈味物質(zhì)，含酸量過低，味淡，酒體不協(xié)調(diào)；含酸量過高，會影響酒體的整體風(fēng)味。表11 黃酒中主要高級醇及其顯味特征Table 11 Main higher alcohols in yellow rice wine and their characteristics of flavor 高級醇顯味特征正丙醇刺激的酒精味，似醚臭，有苦味正丁醇較強的乙醇味和微弱的清香感異丁醇有微弱的戊醇味，有苦味感異戊醇雜醇油味，刺舌頭，稍澀，有香蕉味苯乙醇似玫瑰香味，微帶苦澀 酯類對黃酒風(fēng)味的影響酯類物質(zhì)是黃酒中又一重要的風(fēng)味物質(zhì)，對黃酒的風(fēng)味和品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，通常具有很強的水果味或花香味。尤其是異戊醇含量過高時，由于造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血，而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀。高級醇的種類和含量對黃酒的口感、品質(zhì)有很大的影響，黃酒中所含有的主要高級醇及其風(fēng)味特征見表11。其中，高級醇和酯類是黃酒中最重要的兩類風(fēng)味物質(zhì)，對促進(jìn)黃酒酒體豐滿、濃厚，并增加酒的協(xié)調(diào)性起著重要作用。如何運用研究成果來不斷改進(jìn)黃酒的傳統(tǒng)釀造工藝技術(shù)，如何利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)向生產(chǎn)者和消費者客觀科學(xué)的介紹黃酒的風(fēng)味物質(zhì)，以及進(jìn)一步的改善黃酒的口感和風(fēng)味，達(dá)到吸引更多的消費者等，已經(jīng)成為黃酒行業(yè)發(fā)展中重點研究的當(dāng)務(wù)之急。2013年18月，全國規(guī)模以上的黃酒企業(yè)銷售額同比增加8%，利潤增加19%左右，較其他酒種相對穩(wěn)定。近年來，由于國家政策的支持、黃酒企業(yè)積極引導(dǎo)人們消費，從而黃酒行業(yè)的發(fā)展勢頭良好，且行業(yè)的整體規(guī)模也穩(wěn)步擴大。黃酒除了直接飲用外，還可以入藥，也可以入饌來去腥增香。黃酒是以谷物為主要原料釀制成的糧食酒，它不同于白酒，黃酒是沒有經(jīng)過蒸餾的，酒精含量較低。黃酒由于具有悠久的歷史、豐富的營養(yǎng)、獨特的風(fēng)味、酒精度低等特點[2]，所以受到廣大人民群眾的喜愛。黃酒中還含有