【正文】 非常少，高級酯大部分產生于黃酒陳釀過程中，其含量隨著貯存時間而逐漸升高[7,20]。圖11 高級醇合成途徑 Synthesis pathway of higher alcohols 分解代謝途徑（Ehrlich代謝機制）1907年，德國化學家Ehrlich[28]最早提出了由氨基酸的分解代謝形成高級醇的途徑。Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高級醇[38]，即合成代謝途徑：糖類提供合成氨基酸的碳骨架，然后在合成代謝的最后階段形成α酮酸中間體，α酮酸中間體經脫羧和還原形成相應的高級醇[39]。由于發(fā)酵醪中存在過量的氨基酸時會通過分解代謝途徑轉化為高級醇，因此控制發(fā)酵醪中初始物的濃度可以有利于降低高級醇的生成量[38]。 酵母菌的接種量及增殖倍數黃酒發(fā)酵醪液中，酵母細胞的數量與發(fā)酵力的大小相對應，酵母細胞接種后經過生長繁殖，其數量會達到一定的范圍內，以滿足發(fā)酵力的需要。酵母菌在溶氧高的發(fā)酵條件下形成的高級醇含量明顯增加，這一點在葡萄酒和啤酒的釀造工藝中都有所證實[49]。根據生成高級醇的兩條代謝途徑，選育高級醇代謝過程中某些關鍵性酶活性降低或失活的菌株，從而可以阻斷或減弱生成高級醇的代謝途徑，以達到顯著降低黃酒中高級醇含量的目的[47]。同時也可以利用大孔型吸附樹脂達到定向吸附酒中高級醇分子的目的[53]，從而降低黃酒中的高級醇含量。Rous[55]等人通過紫外誘變的方法選育出一株異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株，用該突變株進行葡萄酒發(fā)酵時生成的異戊醇的含量比出發(fā)菌株降低了50%，同時總高級醇的生成量降低了20%。Nobuhiko[58]等人將賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株K14和呼吸缺陷型菌株NCYC1333進行細胞融合，從而得到了耐酒精力高、絮凝性較低、高級醇生成量適中的優(yōu)良菌株F32。在支鏈氨基酸分解生成高級醇的代謝途徑中，支鏈氨基酸轉氨酶的缺失可阻斷或者減弱支鏈氨基酸轉變成α酮酸的生成量，進而減少亮氨酸生成異戊醇及纈氨酸生成異丁醇的產量。 天冬氨酸β半醛脫氫酶對高級醇生成量的影響Styger[71]等人研究指出，HOM2基因編碼的天冬氨酸β半醛脫氫酶對高級醇的生成有重要影響，構建的HOM2基因缺失菌株生成異丁醇和異戊醇的含量有顯著性降低。許多廠家和科研機構對降低黃酒中高級醇含量進行了大量研究和探討，主要集中在原輔料的選擇和發(fā)酵工藝兩個方面，但是要想從根本上提高黃酒的品質，降低生產成本，最為關鍵的是選育低產高級醇的優(yōu)良釀酒酵母菌株。通過醋酸鋰轉化法將重組片段BAKanMXBB導入本實驗室已構建好的BAT2基因敲除黃酒酵母單倍體菌株中，篩選得到BATBAT2基因雙敲除突變株，并將BATBAT2基因雙敲除突變株及其單敲除突變株與出發(fā)菌株進行黃酒發(fā)酵實驗，研究BATBAT2基因雙敲除對黃酒酵母單倍體菌株的高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。表22 實驗儀器Table 22 Instruments and apparatuses used in this work儀器公司電熱恒溫水浴鍋天津市中環(huán)實驗電爐有限公司恒溫搖床上海制成儀器制品有限公司生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司電子天平梅特勒托利多儀器有限公司高壓蒸汽滅菌鍋山東新華醫(yī)療器械廠 電熱鼓風干燥箱DL102型 天津市實驗器械廠HS1300V型超凈臺蘇州安泰空氣技術有限公司臺式高速離心機上海醫(yī)用分析儀器廠GL20A型高速冷凍離心機中科院生物物理所技術服務公司722型光度分光光度計天津市普瑞斯儀器有限公司pHSJ4A型實驗pH計上?？茖W儀器有限公司P型移液器法國吉爾森公司PCT200型PCR基因擴增儀美國BIORAD公司DYY4c型電泳儀北京市六一儀器廠全自動凝膠成像儀美國SYNGENE公司7890A 氣象色譜儀北京安捷倫科技有限公司 菌種與質粒本實驗中所使用的黃酒酵母菌株、大腸桿菌菌株和質粒載體如表23所示：表23本實驗所使用菌株和質粒的性質及來源Table 23 Strains and plasmids used in this study菌株或質粒背景介紹來源菌株（Strains）RY1工業(yè)用黃酒酵母二倍體天津市工業(yè)微生物重點實驗室RY1a1MATa，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點實驗室RY1α3MATα，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點實驗室RY1a1?bat2MATa ?bat2天津市工業(yè)微生物重點實驗室RY1α3?bat2MATα ?bat2天津市工業(yè)微生物重點實驗室RY11MATa/MATα ?hom2::kan本研究RY12MATa/MATα ?hom2本研究RY13MATa/MATα ?hom2/?hom2::kan本研究RY1a1?bat1MATa ?bat1::kan本研究RY1α3?bat1MATα ?bat1::kan本研究RY1a1?bat1?bat2MATa ?bat2?bat1::kan本研究RY1α3?bat1?bat2MATα ?bat2?bat1::kan本研究質粒（Plasmids）pUC19Ampr，克隆載體天津市工業(yè)微生物重點實驗室pUG6攜帶KanMX抗性基因天津市工業(yè)微生物重點實驗室pGAPza攜帶Zeocin抗性基因天津市工業(yè)微生物重點實驗室pUCBABKAmpr，敲除BAT1基因的重組質粒本研究pUCHABKAmpr，敲除HOM2基因的重組質粒本研究pUCHB1A1KAmpr，敲除HOM2基因的重組質粒本研究 主要培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基（w/v）胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，%，蒸餾水配制，pH ，115℃、 min。（2）斐林甲液分別稱取15 g五水硫酸銅， g次甲基藍，用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（10）60%乙醇溶液量取60 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。當量筒中蒸餾液滴至98 mL左右時停止蒸餾，然后再用蒸餾水補足至100 mL即可。（1）色譜條件氣相色譜儀為Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自動進樣器，色譜柱為 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 30 m320 μm μm ，檢測器為FID。然后再進酒樣進行檢測，就可以根據各物質的保留時間初步定性酒樣中需要檢測的各物質。根據質粒pUG6序列設計一對引物KU和KD擴增KanMX基因，作為抗性篩選標記。表24 PCR反應引物Table 24 PCR primers used in this studyPrimer nameSequence (5′→3′)Restriction siteBAT1U5′ CATGTTGCAGAGACATTCCTTG3′NoneBAT1D5′ CATTAGTTCAAGTCGGCAACAG3′NoneBAU5′CCGGAATTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTG3′EcoRIBAD5′CGCGGATCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAAC 3′BamHIBBU5′CGCGGATCCGTAACTGGTCAAAAACTGTTGCCGA3′BamHIBBD5′TGCACTGCAGCAGCGAGATACCTTGGCAACTAAAT3′PstIBS5′GCATATCTGCTCAAGTAGACAAGG3′NoneKSBAT15′GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA3′NoneKXBAT15′CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC3′NoneBX5′CTGTATGCCACGATGATGGAAGG3′NoneHOM2U5′ TGGGTGCTACTGGTTCCGTTGGT3′NoneHOM2D5′ GGCAATCAAGACACCAGAACCAGC3′NoneHAU5′CCCAAGCTTGCAGCAGCCTTGCCCTTTTACAC3′Hind III HAD5′CGCGGATCC ACCAACGGAACCAGTAGCACCCA 3′BamHIHBU5′CGCGGATCC GGTTCTGGTGTCTTGATTGCCGAAATC3′BamHIHBD5′CGGGGTACCACAGTGCTATTGTGAGTGTATCCCAGC3′KpnIHS5′GCTAAACACGCCTGTGGTCATTC3′NoneKS15′CGGATAAAATGCTTGATGGTCGGA3′NoneKX15′CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGT3′NoneHX5′GGAAGGCACTACTGAGCCAAATG3′NoneHA1U5′CCCAAGCTTGCTGGTGTTTTGGGTGCTACTG3′Hind III HA1D5′CGCGGATCCCGATAGCGCCAGCATAGTCAGC 3′BamHIHB1U5′CGCGGATCCCAAGAACAGACCTGCTCCATCC 3′BamHIHB1D5′CCGGAATTCATCAAGACACCAGAACCAGCGG3′EcoRIKS25′GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA3′NoneKX25′CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC3′NoneKanU5′CGCGGATCCCAGCTGAAGC TTCGTACGC3′BamHIKanD5′CGCGGATCCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG3′BamHIZeocinU5′ATCGTCGACCCCACACACCATAGCTTCA3′NoneZeocinD5′GCGGTCGACAGCTTGCAAATTAAAGCCTT3′None 各目的基因片段的獲得 酵母基因組DNA的提取采用solarbio酵母基因組DNA提取試劑盒提取。（8）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液（在使用之前應先檢查是否已經加入無水乙醇），12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。mol/L) 1 μL模板 μL/基因組1 μLLATaq酶 μLddH2O Add to 20 μL（2）PCR反應條件見表26。（6）接通電泳槽與電泳儀的電源，然后將電壓降選擇1~5 V/cm。 （6）將吸附柱開蓋敞于室溫放置20 min左右，去除殘留乙醇。7）向菌體沉淀中加入40 mL冰浴的 Solution B，輕輕晃動以懸浮菌體沉淀，禁止劇烈振蕩浮。 質粒提取（1）粗提1）從LB平板上挑取單菌落于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，200 rpm過夜培養(yǎng)。3）向EP管中加入250 μL溶液II，并溫和地上下翻轉6～8次，從而使菌體充分裂解。11）離心管中的液體即為提取的質粒，20℃保存?zhèn)溆谩?）將菌液轉至50 mL無菌離心管中，5000 rpm離心5 min，棄除上清液，再用25 mL無菌水洗滌兩次，并棄去上清；4）用1 mL mol/L的LiAc緩沖液重新懸浮酵母菌體， mL的EP管中。 G418抗性基因的去除本研究擬采用CreLoxP報告基因挽救系統(tǒng)[8081]，來剔除報告基因KanMX。3 結果與討論 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因的驗證以提取的黃酒酵母基因組為模板，以BAT1U和BAT1D為引物，通過PCR擴增出基因片段，電泳結果顯示PCR擴增產物較單一，特異性條帶大小為1182 bp，與BATI基因大小一致，證明黃酒酵母基因組上存在完整的BAT1基因（圖31）。 圖34 重組質粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK的酶切驗證 Restriction endonuclease analysis of rebinant plasmids pUCBA, pUCBAB and pUCBABKM：DL5000 DNA marker；1：pUCBA/EcoRIBamHI；2：pUCBAB/PstIBamHI；3：pUCBABK/BamHI BAT1基因敲除突變株的獲得及驗證 重組片段的獲得以構建好的重組質粒pUCBABK為模板，利用引物BAU和BBD擴增2207 bp的重組片段BAKanMXBB，電泳檢測目的片段，結果如圖35。圖37 BAT1基因敲除突變株的PCR驗證 PCR confirmation of mutant strain RY1a1?bat1M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1a1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進行PCR擴增的產物；2：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進行PCR擴增的產物；3：以RY1a1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進行PCR擴增的產物；4：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進行PCR擴增的產物