【正文】 為高級醇，因此控制發(fā)酵醪中初始物的濃度可以有利于降低高級醇的生成量[38]。 碳氮比這里的氮源主要是指氨基酸態(tài)氮，在黃酒釀造過程中，當(dāng)醪液中氨基酸含量較低時，不能滿足酵母菌的生長繁殖需要，酵母菌就會通過Harris途徑合成其所需要的氨基酸，這樣就會形成較多的α酮酸，并經(jīng)過脫羧和還原形成高級醇；當(dāng)醪液中氨基酸含量較高時，酵母的生長繁殖增加，從而也會導(dǎo)致生成的高級醇含量增加，而且某些特定的的氨基酸也可以通過Ehrlich代謝途徑轉(zhuǎn)化形成相應(yīng)的高級醇[45]。因此發(fā)酵醪中的碳氮比控制在能滿足酵母菌的需要的范圍內(nèi)，這樣能夠防止生成過多的高級醇。 酵母菌種同化氨基酸的能力酵母菌吸收氨基酸的主要方式是主動運輸，如果酵母分泌的運輸酶不同，那其同化的氨基酸也就不同[46]。酵母菌在黃酒發(fā)酵過程中，能快速同化的氨基酸只有8種，但是酵母菌生長繁殖過程中需要的不僅僅是這8中氨基酸，所以酵母菌只能依靠自身合成那些不能被自身同化的氨基酸。酵母菌要合成那些不能被自身同化的氨基酸時，由糖代謝途徑提供所需要的酮酸，而α氨基氮來自于能被酵母快速同化的8種氨基酸（經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶脫下）。黃酒發(fā)酵起始時，酵母菌合成的酮酸量能正好滿足合成氨基酸的需要，所以發(fā)酵醪中沒有過量的酮酸，但是隨著發(fā)酵進(jìn)行，由于酵母菌會放慢或者停止合成氨基酸，所以發(fā)酵醪液中就會產(chǎn)生過量的酮酸，而酵母菌無法承受過量酮酸的積累，所以就會通過合成代謝途徑將過量的酮酸轉(zhuǎn)化為高級醇。 因此黃酒中高級醇的含量及種類也與酵母菌同化不同氨基酸的能力有關(guān)。 酵母菌的接種量及增殖倍數(shù)黃酒發(fā)酵醪液中，酵母細(xì)胞的數(shù)量與發(fā)酵力的大小相對應(yīng)，酵母細(xì)胞接種后經(jīng)過生長繁殖，其數(shù)量會達(dá)到一定的范圍內(nèi)，以滿足發(fā)酵力的需要。由于高級醇是酵母生長繁殖過程中合成自身細(xì)胞蛋白時的副產(chǎn)物，所以高級醇的生成是不可避免的，但是高級醇的生成量又是可以控制的，從理論上說，高級醇的生成量會隨著酵母細(xì)胞增殖倍數(shù)的增加而增加，所以合理適當(dāng)?shù)募哟蠼湍妇慕臃N量可以減少其增殖倍數(shù)，由此也相應(yīng)的減少了高級醇的生成量[47]。 發(fā)酵溫度在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度是酵母菌參與生化反應(yīng)的非常重要的外界因素。一般情況下，如果改變發(fā)酵溫度，那么黃酒中高級醇的種類及數(shù)量也會發(fā)生改變，從而影響到各種高級醇之間的平衡[48]。若發(fā)酵溫度過高，那么酵母菌對氨基酸的脫氨基作用就會加速，同時還會加速酵母菌自溶產(chǎn)生大量氨基酸，由于發(fā)酵溫度過高造成的這兩種反應(yīng)都會增加高級醇的生成量。所以通過降低發(fā)酵末期的溫度，抑制酵母菌的活動能力，可以降低高級醇生成量。 溶氧酵母菌屬于兼性厭氧微生物，在有氧條件和無氧條件下均可以生長。但是酵母菌在有氧條件和無氧條件下的生理代謝活動是不同的，酵母菌在高含氧量條件下比在低含氧量條件下的生長代謝旺盛。酵母菌在溶氧高的發(fā)酵條件下形成的高級醇含量明顯增加，這一點在葡萄酒和啤酒的釀造工藝中都有所證實[49]。 其他等因素周天銀等[50]研究發(fā)現(xiàn)，糖化酶的添加量會影響高級醇的生成，并且這一點已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了實踐。當(dāng)發(fā)酵醪中糖化能力不能滿足酵母所需時，為加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使發(fā)酵醪中糖化力與酵母的發(fā)酵力達(dá)到平衡，這樣就加快了酵母的發(fā)酵速度。發(fā)酵過程中，在保證酵母細(xì)胞量充足的情況下，減少其增殖倍數(shù)，這樣酵母細(xì)胞不但能迅速消耗糖分，而且能大大減弱對氨基酸的分解作用，這樣就能大大降低高級醇的生成量。武慶尉等[51]研究發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶的添加量也能改變高級醇的生成量，適當(dāng)?shù)卦黾铀嵝缘鞍酌傅氖褂昧繒r，%，但是酸性蛋白酶的添加量過多時又會使高級醇的含量增加。在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵醪中酵母細(xì)胞的總數(shù)控制在一定范圍內(nèi)，使其發(fā)酵力、糖化力及蛋白分解力三者達(dá)到平衡協(xié)調(diào)時，則能夠更有效的降低高級醇的含量。 除了以上因素，很多文獻(xiàn)中也表明離子水平、pH值等因素也會對發(fā)酵醪中微生物的代謝產(chǎn)生一定的影響，從而進(jìn)一步地影響高級醇的生成量。 降低黃酒中高級醇含量的主要措施 選育低產(chǎn)高級醇黃酒酵母菌株即使在相同的釀造工藝條件下，不同的黃酒酵母菌株由于其生理代謝活動的不同，所以其發(fā)酵過程中生成高級醇的含量也會存在極大的差異。根據(jù)生成高級醇的兩條代謝途徑，選育高級醇代謝過程中某些關(guān)鍵性酶活性降低或失活的菌株，從而可以阻斷或減弱生成高級醇的代謝途徑，以達(dá)到顯著降低黃酒中高級醇含量的目的[47]。 優(yōu)化黃酒發(fā)酵工藝選用蛋白質(zhì)含量低的黃酒生產(chǎn)用原料，并提高原料的精白度，以去除部分原料表皮中所含有的蛋白質(zhì)。以較低溫度浸漬較長時間，以使原料中的部分蛋白質(zhì)因分解而被除去。選擇適宜的制曲工藝，經(jīng)選育得到優(yōu)良的曲霉菌種，以控制其產(chǎn)酶數(shù)量。嚴(yán)格控制黃酒發(fā)酵溫度，使其不能超過工藝要求，并降低發(fā)酵末期的溫度。適當(dāng)增加酵母接種量并嚴(yán)格控制發(fā)酵醪中的溶氧。 黃酒后處理工藝控制高級醇含量根據(jù)高級醇的理化性質(zhì)，可以通過以下方法降低半成品黃酒中的高級醇含量。（1）黃酒中高級醇分子的直徑一般比酒中其他主要成分分子的直徑大，根據(jù)這一特點，可以利用濾膜裝置來截留分子直徑較大的高級醇分子[52]。同時也可以利用大孔型吸附樹脂達(dá)到定向吸附酒中高級醇分子的目的[53]，從而降低黃酒中的高級醇含量。（2）通過通風(fēng)處理、熱處理等一些理化手段[54]，能夠加速酒體中高級醇成酯成酸的生化反應(yīng)，從而不但降低了酒體中高級醇的含量，而且形成了能夠提高黃酒品質(zhì)的風(fēng)味物質(zhì)。 低產(chǎn)高級醇酵母菌株的研究進(jìn)展在酵母發(fā)酵過程中，可以通過優(yōu)化釀酒工藝來控制高級醇的生成，而基于代謝控制理論，通過影響或者改變酵母菌株的代謝途徑，從根本上降低高級醇的生成，不但可以降低生產(chǎn)成本，還能提高黃酒的品質(zhì)。根據(jù)酵母菌生成高級醇的兩條代謝途徑，人們對高級醇的形成及其代謝調(diào)控做了更進(jìn)一步的研究，并且由此產(chǎn)生了一些能夠降低發(fā)酵過程中高級醇生成量的思路和方法。 誘變育種誘變育種是一種有效而且容易操作的育種方法，常用于選育低產(chǎn)高級醇酵母菌株。有多種方法可以對釀酒酵母進(jìn)行誘變處理，其中普遍采用的物理誘變方法為紫外線誘變，化學(xué)誘變方法有亞硝酸誘變、亞硝基胍誘變等。在Ehrlich代謝途徑中，氨基酸分解生成相應(yīng)的高級醇的反應(yīng)過程，是由酵母細(xì)胞中的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、酮酸脫羧酶、脫氫酶等酶的催化活性決定的。因此，根據(jù)代謝控制原理，選育分支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株，由于其不能合成相應(yīng)的氨基酸合成途徑中的某些酶尤其是和高級醇的生成有關(guān)的酶，因而減少了α酮酸的積累，由于α酮酸是合成高級醇的前體物，所以達(dá)到了降低高級醇生成量的目的。Rous[55]等人通過紫外誘變的方法選育出一株異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株，用該突變株進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵時生成的異戊醇的含量比出發(fā)菌株降低了50%，同時總高級醇的生成量降低了20%。王鵬銀[56]等人利用N+離子注入技術(shù)誘變并篩選到了一株亮氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株A713，%，%。趙樹欣[57]等人利用離子注入與紫外誘變經(jīng)二重誘變篩選得到的突變株，%。Ingraham[34]等人選育出了亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株，該突變株發(fā)酵產(chǎn)異戊醇的含量降低了95%，但由于該突變株需要在富含亮氨酸的培養(yǎng)基中生長，而且其發(fā)酵性能也明顯降低，所以限制了該菌在工業(yè)上的應(yīng)用。誘變育種的方法雖然簡單易操作，但其缺點也是顯而易見的。首先，誘變育種得到的菌株大多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型菌株，在其發(fā)酵過程中要向發(fā)酵液中補加維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，所以不利于工業(yè)化生產(chǎn)。其次，進(jìn)行誘變后需要大量處理供試菌株，而且誘變育種的方式由于誘發(fā)突變的盲目性大、難以掌握方向，所以篩選到的目的菌株很少，同時也很難將不同目的性狀集中到同一株菌，另外，篩選得到的目的菌株也容易發(fā)生回復(fù)突變。 細(xì)胞融合育種細(xì)胞融合又稱為原生質(zhì)體融合，該技術(shù)也常用于選育酵母菌種。Nobuhiko[58]等人將賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株K14和呼吸缺陷型菌株NCYC1333進(jìn)行細(xì)胞融合，從而得到了耐酒精力高、絮凝性較低、高級醇生成量適中的優(yōu)良菌株F32。王芬[59]等將發(fā)酵度高、產(chǎn)乙醛量低，但產(chǎn)高級醇含量高的菌株NW745與發(fā)酵度不高但產(chǎn)高級醇量少的菌株JW11進(jìn)行融合反應(yīng)，選育出了發(fā)酵度高且產(chǎn)高級醇量低的優(yōu)良菌株DR92。細(xì)胞融合育種存在過程比較繁瑣且得到的目的菌株后代會出現(xiàn)性狀分離等缺點，因而限制了該技術(shù)在工業(yè)育種方面的應(yīng)用。 基因工程育種基因工程育種指的是利用分子生物學(xué)手段在分子水平上按照人們的意愿對菌株進(jìn)行有目的的改造，從而提高有利發(fā)酵產(chǎn)物的生成量或者降低不利發(fā)酵產(chǎn)物的生成量。與傳統(tǒng)育種方法相比，基因工程育種具有針對性強、遺傳性能穩(wěn)定、周期性短等優(yōu)點，并克服了遠(yuǎn)源雜交不親和性，所以說基因工程育種是一種非常優(yōu)越的育種方法。結(jié)合酵母中高級醇生成的兩條代謝途徑，許多科學(xué)家對降低釀酒酵母生成高級醇的含量，尤其是降低其生成異丁醇和異戊醇的含量進(jìn)行了大量且深入的研究。 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶對高級醇生成量的影響Col243。n[60]，Kispal[61]和Eden[21]等人對酵母中支鏈氨基酸分解生成高級醇的代謝途徑進(jìn)行了大量深入的研究，他們的研究成果表明，該途徑的第一步反應(yīng)為支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用，該反應(yīng)是由支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶控制的，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶分為線粒體支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶兩種，且分別由BAT1基因和BAT2基因編碼，釀酒酵母中，BAT1基因編碼的線粒體支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶在其對數(shù)生長期活性很高，但是在穩(wěn)定期活性較低；而BAT2基因編碼的細(xì)胞質(zhì)氨基酸轉(zhuǎn)氨酶在其穩(wěn)定期活性很高，但在對數(shù)期活性較低[6162]。在支鏈氨基酸分解生成高級醇的代謝途徑中，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的缺失可阻斷或者減弱支鏈氨基酸轉(zhuǎn)變成α酮酸的生成量，進(jìn)而減少亮氨酸生成異戊醇及纈氨酸生成異丁醇的產(chǎn)量。Eden[21]等人的研究結(jié)果表明，敲除BAT1基因或者敲除BAT2基因時，都基本沒有影響正丙醇的生成量，但敲除BAT2基因?qū)Ξ惗〈己彤愇齑嫉纳闪坑休^大的影響。Yoshimoto[63]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變株發(fā)酵生成異丁醇和異戊醇的產(chǎn)量分別降低了72%和40%。Lilly[64]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變菌株發(fā)酵生成異丁醇的含量顯著下降。Nissim[65]等人構(gòu)建的BAT1和BAT2基因敲除的突變株，其異丁醇的生成量顯著降低，但是沒有報導(dǎo)該突變株異戊醇的生成量及其發(fā)酵性能的變化情況。丙酮酸脫羧酶是氨基酸分解代謝途徑中催化α酮酸脫羧成醛的關(guān)鍵酶，Yoshimoto[66]等人構(gòu)建了編碼丙酮酸脫羧酶的PDC1基因缺失的突變株，其異戊醇的生成量下降了31%。Dickenson[6769]等人研究發(fā)現(xiàn)，由YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶是α酮基異己酸分解形成異戊醇的關(guān)鍵酶，構(gòu)建YDL080C基因缺失的突變株，能夠阻斷或者減弱α酮基異己酸轉(zhuǎn)化形成異戊醇的途徑，從而降低異戊醇的生成量。醇脫氫酶是高級醇形成途徑中催化醛類還原形成高級醇的重要酶，Atsumi[70]等人指出ADH2基因編碼的醇脫氫酶是催化異丁醛和異戊醛形成異丁醇和異戊醇的關(guān)鍵性酶，通過過量表達(dá)ADH2基因，顯著提高了異丁醇和異戊醇的生成量。 天冬氨酸β半醛脫氫酶對高級醇生成量的影響Styger[71]等人研究指出，HOM2基因編碼的天冬氨酸β半醛脫氫酶對高級醇的生成有重要影響，構(gòu)建的HOM2基因缺失菌株生成異丁醇和異戊醇的含量有顯著性降低。 醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶對高級醇生成量的影響Yoshimoto[63]等人構(gòu)建的過表達(dá)ATF1的菌株，其發(fā)酵生成異戊醇和異丁醇的含量分別降低了74%和52%；Fukuda[72]等人構(gòu)建的同時過表達(dá)ATF1和ATF2的菌株，不但提高了菌株乙酸酯合成酶的活力，而且還顯著降低了異戊醇的生成量；本實驗室張建煒[73]等人構(gòu)建的過量表達(dá)ATF1的菌株，其生成異戊醇的含量下降了50%。 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容黃酒是我國的民族特產(chǎn)，深受廣大人民群眾的喜愛。人們的生活水平和物質(zhì)文化日益提高，同時消費者對黃酒這種消費品的品質(zhì)要求也在不斷提高和變化，包括黃酒的風(fēng)味口感和營養(yǎng)價值等，特別是消費者隨著對黃酒的認(rèn)識越來越高，對形成其風(fēng)味的微量成分也越來越重視。高級醇是黃酒的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，適宜的高級醇含量及各種高級醇含量之間比例的協(xié)調(diào)可以使酒體豐滿圓潤，口感柔和協(xié)調(diào)；如果高級醇含量過高，不但會給酒體帶來不愉快的異雜味，影響黃酒的品質(zhì)，而且有較強的致醉性，危害人的身體健康。目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的。因此降低黃酒中高級醇含量適應(yīng)健康、安全、衛(wèi)生的消費趨勢。利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)降低黃酒中高級醇含量是我國黃酒釀造行業(yè)重要的研究課題。許多廠家和科研機構(gòu)對降低黃酒中高級醇含量進(jìn)行了大量研究和探討，主要集中在原輔料的選擇和發(fā)酵工藝兩個方面，但是要想從根本上提高黃酒的品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，最為關(guān)鍵的是選育低產(chǎn)高級醇的優(yōu)良釀酒酵母菌株。釀酒酵母生成高級醇的兩條代謝途徑是在眾多酶的催化作用下完成的，這些酶分別是由一個或一系列相關(guān)基因編碼的，為確定影響高級醇代謝途徑的關(guān)鍵基因，本實驗擬采用基因工程育種手段，敲除某些直接或間接參與高級醇代謝途徑的酶的編碼基因，研究基因敲除對高級醇生成量的影響。本實驗室前期實驗過程中，郝欣等人構(gòu)建了BAT2基因敲除突變株，該突變株進(jìn)行酒精濃醪發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，突變株的基本發(fā)酵性能與出發(fā)菌株基本相同，產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了55%和34%；戴龍海等人構(gòu)建了BAT2基因敲除單倍體菌株，該突變株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，突變株產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了37%和12%左右，同時，敲除BAT2基因?qū)S酒酵母菌株的基本發(fā)酵性能無明顯影響。以上結(jié)果顯示，BAT2基因敲除對異丁醇的生成量有顯著影響，對黃酒中含量最高的異戊醇的生成量影響不太顯著，而對正丙醇則沒有影響，本課題將繼續(xù)研究高級醇代謝途徑中的相關(guān)基因?qū)Ω呒壌忌闪康挠绊?。本課題的目的是在探討釀酒酵母高級醇代謝機理的基礎(chǔ)上，研究BATHOM2基因敲除以及BAT1和BAT2基因雙敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響，為理論研究提供指導(dǎo)。 本課題的主要研究內(nèi)容本課題擬從以下幾個方面展開研究：（1）BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組