【正文】 表31 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 31 Basic fermentation performances of BAT1 mutant strains and parent strains菌株CO2累計失重 （g） 酒度（%，v/v）殘?zhí)牵╣/100 mL）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3? g，結(jié)果均與出發(fā)菌株接近，同時殘?zhí)橇恳捕嫉陀? g/100mL，表示BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵均很徹底。結(jié)果顯示PCR擴增產(chǎn)物單一，特異性條帶大小正確。圖31 BAT1基因的PCR產(chǎn)物 PCR production of BAT1M：DL5000 DNA Marker；1：BAT1 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 目的片段的擴增以黃酒酵母基因組為模板，利用引物BAU和BAD擴增BAT1基因上游的BA片段，利用引物BBU和BBD擴增BAT1基因下游的BB片段, 以質(zhì)粒pUG6為模板，利用引物KanU和KanD擴增KanMX基因片段，電泳檢測擴增片段，結(jié)果如圖32所示。首先利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pGAPza轉(zhuǎn)入酵母中，然后通過半乳糖誘導(dǎo)后，稀釋涂布于無抗性的YEPD平板。5）離心，棄除上清， mL的LiAc/TE緩沖液重新懸浮，每管50 μL進行分裝，離心后，用移液槍小心吸除上清，并立即進行轉(zhuǎn)化。 質(zhì)粒載體和目的片段的酶切質(zhì)粒和目的片段的酶切體系如表27：表27 酶切體系Table 27 Components of enzyme digestion system組分加樣量10Buffer 10 μL質(zhì)?！?2 μg酶2 μLddH2OAdd to 40 μL反應(yīng)條件為37℃（或30℃）水浴3~4 h，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。4）向EP管中加入350 μL溶液III，并馬上溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次以充分混勻，此時將會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，然后12000 rpm離心10 min。2） mL的EP管中，12000 rpm離心1 min。8） mL EP管分裝，100 μL/管。 （7）將吸附柱置于新的離心管中，加入20～100μL洗脫液，靜置2 min。（7）根據(jù)上樣緩沖液遷移的位置判斷是否終止電泳，切斷電源，取出凝膠后放于EB溶液中，浸泡時間約為10 min；（8）從EB溶液中取出凝膠后放入凝膠成像系統(tǒng)中檢測電泳結(jié)果，并保存電泳圖片。 表26 PCR反應(yīng)條件Table 26 Reaction conditions of PCR 步驟溫度時間預(yù)變性95℃5 min變性94℃40 s退火X℃1 min延伸72℃13 min終延伸72℃10 min 注：X與引物有關(guān)，一般比其Tm值小5 ℃~10 ℃ 變性至延伸部分共循環(huán)30次，退火溫度X由各目的基因片段的引物情況決定。（9）向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。其操作步驟如下:（1）取斜面酵母菌種一環(huán)于裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。在BA片段的上游設(shè)計引物BS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計引物KSBAT1用于BAT1基因單敲除突變株的上游驗證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計引物KXBAT1和在BB片段的下游設(shè)計引物BX用于BAT1基因單敲除突變株的下游驗證。根據(jù)各物質(zhì)的峰面積用內(nèi)標法進一步定量計算各物質(zhì)的含量。進樣口的溫度為 220℃，檢測器的溫度為250℃。蒸餾結(jié)束后用酒精計測定蒸餾液酒精度，同時用溫度計測量蒸餾液的溫度，最后將該溫度下測定的酒精度換算成20℃條件下的酒精度。（11）20%乙醇溶液量取20 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。（3）斐林乙液分別稱取50 g酒石酸鉀鈉，54 g氫氧化鈉，以及4 g亞鐵氰化鉀，用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（2）YEPD培養(yǎng)基（w/v）葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。（3）HOM2基因一個等位基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。釀酒酵母生成高級醇的兩條代謝途徑是在眾多酶的催化作用下完成的，這些酶分別是由一個或一系列相關(guān)基因編碼的，為確定影響高級醇代謝途徑的關(guān)鍵基因，本實驗擬采用基因工程育種手段，敲除某些直接或間接參與高級醇代謝途徑的酶的編碼基因，研究基因敲除對高級醇生成量的影響。 醇乙?；D(zhuǎn)移酶對高級醇生成量的影響Yoshimoto[63]等人構(gòu)建的過表達ATF1的菌株，其發(fā)酵生成異戊醇和異丁醇的含量分別降低了74%和52%；Fukuda[72]等人構(gòu)建的同時過表達ATF1和ATF2的菌株，不但提高了菌株乙酸酯合成酶的活力，而且還顯著降低了異戊醇的生成量；本實驗室張建煒[73]等人構(gòu)建的過量表達ATF1的菌株，其生成異戊醇的含量下降了50%。Eden[21]等人的研究結(jié)果表明，敲除BAT1基因或者敲除BAT2基因時，都基本沒有影響正丙醇的生成量，但敲除BAT2基因?qū)Ξ惗〈己彤愇齑嫉纳闪坑休^大的影響。王芬[59]等將發(fā)酵度高、產(chǎn)乙醛量低，但產(chǎn)高級醇含量高的菌株NW745與發(fā)酵度不高但產(chǎn)高級醇量少的菌株JW11進行融合反應(yīng)，選育出了發(fā)酵度高且產(chǎn)高級醇量低的優(yōu)良菌株DR92。王鵬銀[56]等人利用N+離子注入技術(shù)誘變并篩選到了一株亮氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株A713，%，%。（2）通過通風處理、熱處理等一些理化手段[54]，能夠加速酒體中高級醇成酯成酸的生化反應(yīng)，從而不但降低了酒體中高級醇的含量，而且形成了能夠提高黃酒品質(zhì)的風味物質(zhì)。 優(yōu)化黃酒發(fā)酵工藝選用蛋白質(zhì)含量低的黃酒生產(chǎn)用原料，并提高原料的精白度，以去除部分原料表皮中所含有的蛋白質(zhì)。 其他等因素周天銀等[50]研究發(fā)現(xiàn)，糖化酶的添加量會影響高級醇的生成，并且這一點已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了實踐。由于高級醇是酵母生長繁殖過程中合成自身細胞蛋白時的副產(chǎn)物，所以高級醇的生成是不可避免的，但是高級醇的生成量又是可以控制的，從理論上說，高級醇的生成量會隨著酵母細胞增殖倍數(shù)的增加而增加，所以合理適當?shù)募哟蠼湍妇慕臃N量可以減少其增殖倍數(shù)，由此也相應(yīng)的減少了高級醇的生成量[47]。 碳氮比這里的氮源主要是指氨基酸態(tài)氮，在黃酒釀造過程中，當醪液中氨基酸含量較低時，不能滿足酵母菌的生長繁殖需要，酵母菌就會通過Harris途徑合成其所需要的氨基酸，這樣就會形成較多的α酮酸，并經(jīng)過脫羧和還原形成高級醇；當醪液中氨基酸含量較高時，酵母的生長繁殖增加，從而也會導(dǎo)致生成的高級醇含量增加，而且某些特定的的氨基酸也可以通過Ehrlich代謝途徑轉(zhuǎn)化形成相應(yīng)的高級醇[45]。Webb[40]和Ingraham[34,4142]于1963年，共同提出了異丁醇的糖代謝合成途徑。1911年，Neubauer[29]等人對Ehrlich代謝途徑進行了進一步的補充，即推斷a酮酸是高級醇代謝過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，a酮酸經(jīng)脫羧轉(zhuǎn)化成醛，醛再進一步還原為相應(yīng)的高級醇。黃酒中常見的酯類及其所呈現(xiàn)的風味特征見表12，由表可知，黃酒中常見酯類對黃酒風味有著正面的作用，所以可以通過適當?shù)奶岣哌@些有著積極作用的酯類的含量，來進一步改善黃酒的品質(zhì)。另外，高級醇含量過高對人體有毒害作用，其毒性會隨著分子量的增大而加劇。黃酒中的風味物質(zhì)種類非常豐富，主要包括醇類、酸類、酯類、醛類及羰基化合物等，其中酸類是黃酒中的重要呈味物質(zhì)，而醇類、酯類和醛類則是黃酒香氣的骨架成分，這些風味物質(zhì)之間具有風味累加、相殺作用或風味協(xié)同作用，從而形成了黃酒特有的復(fù)合香[810]。%；，%；，%。黃酒中還含有豐富的人體所必需的微量元素、有機酸和各種維生素[34]。黃酒是以谷物為主要原料釀制成的糧食酒，它不同于白酒，黃酒是沒有經(jīng)過蒸餾的，酒精含量較低。近年來，由于國家政策的支持、黃酒企業(yè)積極引導(dǎo)人們消費，從而黃酒行業(yè)的發(fā)展勢頭良好，且行業(yè)的整體規(guī)模也穩(wěn)步擴大。如何運用研究成果來不斷改進黃酒的傳統(tǒng)釀造工藝技術(shù)，如何利用現(xiàn)代科學技術(shù)向生產(chǎn)者和消費者客觀科學的介紹黃酒的風味物質(zhì)，以及進一步的改善黃酒的口感和風味，達到吸引更多的消費者等，已經(jīng)成為黃酒行業(yè)發(fā)展中重點研究的當務(wù)之急。高級醇的種類和含量對黃酒的口感、品質(zhì)有很大的影響，黃酒中所含有的主要高級醇及其風味特征見表11。表11 黃酒中主要高級醇及其顯味特征Table 11 Main higher alcohols in yellow rice wine and their characteristics of flavor 高級醇顯味特征正丙醇刺激的酒精味，似醚臭，有苦味正丁醇較強的乙醇味和微弱的清香感異丁醇有微弱的戊醇味，有苦味感異戊醇雜醇油味，刺舌頭，稍澀，有香蕉味苯乙醇似玫瑰香味，微帶苦澀 酯類對黃酒風味的影響酯類物質(zhì)是黃酒中又一重要的風味物質(zhì)，對黃酒的風味和品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，通常具有很強的水果味或花香味。 黃酒發(fā)酵過程中高級醇的形成與控制 高級醇的形成機理研究表明，在釀酒過程的主發(fā)酵期間，酵母菌的生長繁殖伴隨著高級醇的生成，80%的高級醇是在這段時間逐漸形成的[21]，酵母生成高級醇的代謝途徑有兩個(圖11)：一是分解代謝途徑即Ehrlich途徑，由氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑生成α酮酸[2223]，α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級醇；二是糖代謝途徑即Harris途徑，由葡萄糖經(jīng)過EMP途徑以及TCA循環(huán)生成α酮酸[2425],α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級醇。表13 氨基酸代謝產(chǎn)物與其相應(yīng)的高級醇Table 13 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol氨基酸α酮酸高級醇亮氨酸α異己酸異戊醇異亮氨酸α酮基β甲基戊酸活性戊醇纈氨酸α酮基異戊酸異丁醇蘇氨酸α酮基丁酸丙醇苯丙氨酸3苯基2酮基丙酸苯丙醇 合成代謝途徑（Harris途徑）經(jīng)過進一步研究得知，氨基酸分解代謝途徑并不是高級醇生成的唯一途徑，主要依據(jù)可以歸納為以下幾點：（1）在合成培養(yǎng)基中進行酒精發(fā)酵時，培養(yǎng)基中加入的氨基酸種類與生成的高級醇種類不具有相關(guān)性；（2）高級醇的生成速率與乙醇的形成速率相平行，與培養(yǎng)基中氨基酸含量的高低無關(guān)；（3）酵母在含有單一氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時，仍能形成各種高級醇；（4）高級醇中的某些組成（如正丁醇，其相應(yīng)的氨基酸為纈氨酸）在自然界中并不存在。黃酒釀造過程中的微生物數(shù)量多且種類廣，除了酵母菌，還包括細菌、霉菌等，這些微生物死亡后自溶于發(fā)酵醪液中，也會提供豐富的蛋白質(zhì)[44]。黃酒發(fā)酵起始時，酵母菌合成的酮酸量能正好滿足合成氨基酸的需要，所以發(fā)酵醪中沒有過量的酮酸，但是隨著發(fā)酵進行，由于酵母菌會放慢或者停止合成氨基酸，所以發(fā)酵醪液中就會產(chǎn)生過量的酮酸，而酵母菌無法承受過量酮酸的積累，所以就會通過合成代謝途徑將過量的酮酸轉(zhuǎn)化為高級醇。 溶氧酵母菌屬于兼性厭氧微生物，在有氧條件和無氧條件下均可以生長。 除了以上因素，很多文獻中也表明離子水平、pH值等因素也會對發(fā)酵醪中微生物的代謝產(chǎn)生一定的影響，從而進一步地影響高級醇的生成量。 黃酒后處理工藝控制高級醇含量根據(jù)高級醇的理化性質(zhì)，可以通過以下方法降低半成品黃酒中的高級醇含量。在Ehrlich代謝途徑中，氨基酸分解生成相應(yīng)的高級醇的反應(yīng)過程，是由酵母細胞中的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、酮酸脫羧酶、脫氫酶等酶的催化活性決定的。其次，進行誘變后需要大量處理供試菌株，而且誘變育種的方式由于誘發(fā)突變的盲目性大、難以掌握方向，所以篩選到的目的菌株很少，同時也很難將不同目的性狀集中到同一株菌，另外，篩選得到的目的菌株也容易發(fā)生回復(fù)突變。 支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶對高級醇生成量的影響Col243。Dickenson[6769]等人研究發(fā)現(xiàn)，由YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶是α酮基異己酸分解形成異戊醇的關(guān)鍵酶，構(gòu)建YDL080C基因缺失的突變株，能夠阻斷或者減弱α酮基異己酸轉(zhuǎn)化形成異戊醇的途徑，從而降低異戊醇的生成量。因此降低黃酒中高級醇含量適應(yīng)健康、安全、衛(wèi)生的消費趨勢。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段BAKanMXBB導(dǎo)入黃酒酵母單倍體出發(fā)菌株中，篩選得到BAT1基因敲除突變株，并將BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株進行黃酒發(fā)酵實驗，研究BAT1基因敲除對黃酒酵母單倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。63天津科技大學碩士學位論文2 材料與方法 材料與儀器 主要試劑本論文所用實驗試劑如表21所示。以上前四種培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需再加2%的瓊脂。（8）1 mol/L醋酸鋰 g醋酸鋰，然后用蒸餾水定容至100 mL，最后再過濾除菌。用100 mL的量筒量取100 mL發(fā)酵液于1000 mL的蒸餾瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，再加入適量的消泡劑，搖勻，接入蒸餾裝置，并用100 mL量筒作為接收器收集蒸餾液。（3）測定吸取斐林甲液、乙溶液各5 mL于150 mL的三角瓶中，然后加入1mL經(jīng)過適當稀釋的樣品稀釋液以及9 mL蒸餾水，其余操作過程同上。（3）分析方法保留時間法為氣相色譜定性鑒定中最常用的分析方法，在一定的色譜條件下，各物質(zhì)的出峰時間保持不變。（1）BAT1基因單敲除突變株及BATBAT2基因雙敲除突變株的構(gòu)建及驗證所需引物根據(jù)GenBank報道的BAT1基因序列設(shè)計一對引物BAT1U和BAT1D，用于驗證黃酒酵母基因組中BAT1基因的存在。（3）HOM2基因兩