【正文】 圖36 BAKanMXBB片段與黃酒酵母基因組同源重組過程 Double homologous rebination between BAKanMXBB cassette and BAT1 gene in yellow wine yeast挑取G418平板上長出的轉(zhuǎn)化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并提取其基因組，然后以此基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。（3）二級種子培養(yǎng)：取一級種子液2 mL接種到裝有100 mL麥汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，30℃靜置培養(yǎng)24 h。 質(zhì)粒載體與目的片段的連接 質(zhì)粒載體與目的片段進(jìn)行連接的體系見表29：表29 連接體系Table 29 Components of ligation system組分加樣量載體DNAx μL目的片段y μLSolution I5 μL反應(yīng)條件：載體與目的片段的摩爾比為1:31:10，16℃恒溫條件下連接過夜。（2）采用solarbio質(zhì)粒小提試劑盒精提。4）將菌液立即放置于冰上預(yù)冷10 min，4℃，5000 rpm離心5 min，棄除上清，收集大腸桿菌的菌體沉淀。（3）室溫條件下放置30~45 min，直到瓊脂糖溶液完全凝固，小心地拔出梳子后，將凝膠放置于電泳槽中。（5）然后加入20 μL（10 mg/mL）的蛋白酶K，并充分顛倒混勻，在65℃水浴中消化15~30min，消化期間可以顛倒混勻數(shù)次，直到樣品完全消化為止。 實(shí)驗(yàn)方法 引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)中所用全部引物序列見表24。在電爐上加熱至沸騰，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定直至藍(lán)色消失，此滴定操作過程要求操作準(zhǔn)確并且迅速，需要在1 min以內(nèi)完成，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積。（7）50TAE緩沖液分別取242 gTris， mL冰醋酸，和100 mL mol/L的Na2EDTA（pH ），然后用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHB1A1K，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HA1KanMXHB1導(dǎo)入HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株中，篩選得到HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株與HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株及二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究HOM2基因兩個(gè)等位基因的敲除對黃酒酵母二倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的。結(jié)合酵母中高級醇生成的兩條代謝途徑，許多科學(xué)家對降低釀酒酵母生成高級醇的含量，尤其是降低其生成異丁醇和異戊醇的含量進(jìn)行了大量且深入的研究。有多種方法可以對釀酒酵母進(jìn)行誘變處理，其中普遍采用的物理誘變方法為紫外線誘變，化學(xué)誘變方法有亞硝酸誘變、亞硝基胍誘變等。在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵醪中酵母細(xì)胞的總數(shù)控制在一定范圍內(nèi)，使其發(fā)酵力、糖化力及蛋白分解力三者達(dá)到平衡協(xié)調(diào)時(shí)，則能夠更有效的降低高級醇的含量。酵母菌要合成那些不能被自身同化的氨基酸時(shí)，由糖代謝途徑提供所需要的酮酸，而α氨基氮來自于能被酵母快速同化的8種氨基酸（經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶脫下）。各種氨基酸與相應(yīng)的高級醇之間的關(guān)系見表13。黃酒中高級醇含量過高對人體有毒害作用這一點(diǎn)已經(jīng)引起了消費(fèi)者和生產(chǎn)者的高度重視，而且目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的[18]，因此采取安全有效的解決措施，達(dá)到控制黃酒中的高級醇含量在適宜的范圍內(nèi)，對提高黃酒的品質(zhì)和地位、以及進(jìn)一步擴(kuò)展黃酒市場具有重要意義。傳統(tǒng)的黃酒產(chǎn)品介紹與宣傳已經(jīng)開始制約著消費(fèi)群體的進(jìn)一步快速擴(kuò)大，同時(shí)也制約著地域性市場的進(jìn)一步拓展。黃酒由于具有悠久的歷史、豐富的營養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味、酒精度低等特點(diǎn)[2]，所以受到廣大人民群眾的喜愛。2013年18月，全國規(guī)模以上的黃酒企業(yè)銷售額同比增加8%，利潤增加19%左右，較其他酒種相對穩(wěn)定。尤其是異戊醇含量過高時(shí)，由于造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血，而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀。隨后，Lampitt[30]，Yamada[31]，Thorne[3233]，Ingraham[34]等進(jìn)一步研究證實(shí)氨基酸的分解代謝生成各種高級醇。因此發(fā)酵醪中的碳氮比控制在能滿足酵母菌的需要的范圍內(nèi)，這樣能夠防止生成過多的高級醇。當(dāng)發(fā)酵醪中糖化能力不能滿足酵母所需時(shí)，為加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使發(fā)酵醪中糖化力與酵母的發(fā)酵力達(dá)到平衡，這樣就加快了酵母的發(fā)酵速度。 低產(chǎn)高級醇酵母菌株的研究進(jìn)展在酵母發(fā)酵過程中，可以通過優(yōu)化釀酒工藝來控制高級醇的生成，而基于代謝控制理論，通過影響或者改變酵母菌株的代謝途徑，從根本上降低高級醇的生成，不但可以降低生產(chǎn)成本，還能提高黃酒的品質(zhì)。細(xì)胞融合育種存在過程比較繁瑣且得到的目的菌株后代會出現(xiàn)性狀分離等缺點(diǎn)，因而限制了該技術(shù)在工業(yè)育種方面的應(yīng)用。 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容黃酒是我國的民族特產(chǎn)，深受廣大人民群眾的喜愛。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HAKanMXHB導(dǎo)入黃酒酵母二倍體出發(fā)菌株中，篩選得到HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株與二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究HOM2基因一個(gè)等位基因的敲除對黃酒酵母二倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。（4）100 mg/mL氨芐青霉素溶液稱取10 g氨芐青霉素，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。 還原糖的測定[75]利用斐林試劑法測定發(fā)酵液中還原糖的含量。 生長曲線的測定（1）取斜面菌種一環(huán)接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃條件下靜置培養(yǎng)12 h。（2）取適量酵母菌液（不超過5107 cells） mL EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清；向菌體中加入470 μL山梨醇Buffer，充分懸浮酵母菌體，再加入25 μL酵母破壁酶及5 μL β巰基乙醇，上下顛倒充分混勻，30℃溫度下放置1~2 h。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。 （8）12000 rpm離心1 min，離心管內(nèi)的溶液即為純化的DNA溶液，20℃保存 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備采用TAKARA的Competent Cell Preparation Kit制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：1）取70℃保存的大腸桿菌DH5α在LB平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。3）棄除上清，剩余大約50 μL液體，用移液槍吹打混勻菌體。 酶切載體的去磷酸化選用牛小腸堿性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）對酶切回收后的載體進(jìn)行去磷酸化處理，如表28，去磷酸化體系按照60 μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行。待培養(yǎng)出單菌落之后，將單菌落對應(yīng)點(diǎn)接到無抗性的YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板上，置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)2~4 d，挑取在無抗性YEPD平板上生長而在含G418抗性平板上不生長的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的KanMX基因是否去除。 圖35重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物 PCR rebinant fragment BAKanMXBBM：DL5000 DNA Marker；1：BAKanMXBB 突變株的獲得及驗(yàn)證將重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物回收，然后通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段分別導(dǎo)入黃酒酵母單倍體RY1a1與RY1α3，通過BA片段和BB片段與酵母染色體上BAT1基因兩側(cè)的同源序列同時(shí)發(fā)生同源重組（圖36），從而整合到酵母染色體上并隨其一起復(fù)制，重組過程實(shí)現(xiàn)了BAT1基因被KanMX基因完全替換，從而實(shí)現(xiàn)BAT1基因的敲除，KanMX基因的引入使突變株產(chǎn)生G418抗性，可以作為篩選標(biāo)記。圖37 BAT1基因敲除突變株的PCR驗(yàn)證 PCR confirmation of mutant strain RY1a1?bat1M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1a1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；2：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；3：以RY1a1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；4：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較將構(gòu)建好的BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3?bat1與出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過程中記錄CO2失重情況，發(fā)酵結(jié)束后測量發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?，蒸餾發(fā)酵液并測量其酒精含量，結(jié)果見表31所示。3 結(jié)果與討論 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因的驗(yàn)證以提取的黃酒酵母基因組為模板，以BAT1U和BAT1D為引物，通過PCR擴(kuò)增出基因片段，電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較單一，特異性條帶大小為1182 bp，與BATI基因大小一致，證明黃酒酵母基因組上存在完整的BAT1基因（圖31）。3）將菌液轉(zhuǎn)至50 mL無菌離心管中，5000 rpm離心5 min，棄除上清液，再用25 mL無菌水洗滌兩次，并棄去上清；4）用1 mL mol/L的LiAc緩沖液重新懸浮酵母菌體， mL的EP管中。3）向EP管中加入250 μL溶液II，并溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，從而使菌體充分裂解。7）向菌體沉淀中加入40 mL冰浴的 Solution B，輕輕晃動(dòng)以懸浮菌體沉淀，禁止劇烈振蕩浮。（6）接通電泳槽與電泳儀的電源，然后將電壓降選擇1~5 V/cm。（8）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液（在使用之前應(yīng)先檢查是否已經(jīng)加入無水乙醇），12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。根據(jù)質(zhì)粒pUG6序列設(shè)計(jì)一對引物KU和KD擴(kuò)增KanMX基因，作為抗性篩選標(biāo)記。（1）色譜條件氣相色譜儀為Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱為 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 30 m320 μm μm ，檢測器為FID。（10）60%乙醇溶液量取60 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。表22 實(shí)驗(yàn)儀器Table 22 Instruments and apparatuses used in this work儀器公司電熱恒溫水浴鍋天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司恒溫?fù)u床上海制成儀器制品有限公司生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司電子天平梅特勒托利多儀器有限公司高壓蒸汽滅菌鍋山東新華醫(yī)療器械廠 電熱鼓風(fēng)干燥箱DL102型 天津市實(shí)驗(yàn)器械廠HS1300V型超凈臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司臺式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠GL20A型高速冷凍離心機(jī)中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司722型光度分光光度計(jì)天津市普瑞斯儀器有限公司pHSJ4A型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)上?？茖W(xué)儀器有限公司P型移液器法國吉爾森公司PCT200型PCR基因擴(kuò)增儀美國BIORAD公司DYY4c型電泳儀北京市六一儀器廠全自動(dòng)凝膠成像儀美國SYNGENE公司7890A 氣象色譜儀北京安捷倫科技有限公司 菌種與質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)中所使用的黃酒酵母菌株、大腸桿菌菌株和質(zhì)粒載體如表23所示：表23本實(shí)驗(yàn)所使用菌株和質(zhì)粒的性質(zhì)及來源Table 23 Strains and plasmids used in this study菌株或質(zhì)粒背景介紹來源菌株（Strains）RY1工業(yè)用黃酒酵母二倍體天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1a1MATa，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1α3MATα，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1a1?bat2MATa ?bat2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1α3?bat2MATα ?bat2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY11MATa/MATα ?hom2::kan本研究RY12MATa/MATα ?hom2本研究RY13MATa/MATα ?hom2/?hom2::kan本研究RY1a1?bat1MATa ?bat1::kan本研究RY1α3?bat1MATα ?bat1::kan本研究RY1a1?bat1?bat2MATa ?bat2?bat1::kan本研究RY1α3?bat1?bat2MATα ?bat2?bat1::kan本研究質(zhì)粒（Plasmids）pUC19Ampr，克隆載體天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pUG6攜帶KanMX抗性基因天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pGAPza攜帶Zeocin抗性基因天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pUCBABKAmpr，敲除BAT1基因的重組質(zhì)粒本研究pUCHABKAmpr，敲除HOM2基因的重組質(zhì)粒本研究pUCHB1A1KAmpr，敲除HOM2基因的重組質(zhì)粒本研究 主要培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基（w/v）胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，%，蒸餾水配制，pH ，115℃、 min。許多廠家和科研機(jī)構(gòu)對降低黃酒中高級醇含量進(jìn)行了大量研究和探