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基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響畢業(yè)論文(已修改)

2025-07-05 04:30 本頁(yè)面
 

【正文】 天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響畢業(yè)論文目 錄1 前 言 1 黃酒概述 1 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述 1 高級(jí)醇對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 2 酯類對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 3 其他類物質(zhì)對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 3 黃酒發(fā)酵過(guò)程中高級(jí)醇的形成與控制 3 高級(jí)醇的形成機(jī)理 3 影響黃酒中高級(jí)醇含量的主要因素 6 降低黃酒中高級(jí)醇含量的主要措施 7 低產(chǎn)高級(jí)醇酵母菌株的研究進(jìn)展 8 誘變育種 8 細(xì)胞融合育種 9 基因工程育種 9 本課題的立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容 10 10 本課題的主要研究?jī)?nèi)容 112 材料與方法 13 材料與儀器 13 主要試劑 13 主要實(shí)驗(yàn)儀器 14 菌種與質(zhì)粒 15 主要培養(yǎng)基 15 主要溶液 16 分析方法 17 CO2失重的測(cè)定 17 酒精度的測(cè)定 17 還原糖的測(cè)定 17 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定 18 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 18 實(shí)驗(yàn)方法 19 引物設(shè)計(jì) 19 各目的基因片段的獲得 21 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 23 酵母轉(zhuǎn)化 25 G418抗性基因的去除 26 黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 263 結(jié)果與討論 28 BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 28 BAT1基因的驗(yàn)證 28 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 28 BAT1基因敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 30 BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 32 小結(jié)與討論 33 BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 33 BATBAT2基因雙敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 33 突變株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)性能的比較 34 BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 35 小結(jié)與討論 36 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 37 HOM2基因的驗(yàn)證 37 重組質(zhì)粒pUCHABK的構(gòu)建 38 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株的獲得及驗(yàn)證 40 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 41 遺傳標(biāo)記基因KanMX的去除 42 小結(jié)與討論 44 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 44 重組質(zhì)粒pUCHB1A1K的構(gòu)建 44 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株的獲得及驗(yàn)證 47 突變株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)性能的比較 48 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 49 小結(jié)與討論 504 結(jié) 論 515 展 望 526 參考文獻(xiàn) 537 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況 588 致 謝 591 前 言 黃酒概述黃酒是我國(guó)的民族特產(chǎn),至今已經(jīng)有7千年的歷史,與啤酒、葡萄酒并稱為世界上三大最古老的釀造酒[1]。黃酒由于具有悠久的歷史、豐富的營(yíng)養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味、酒精度低等特點(diǎn)[2],所以受到廣大人民群眾的喜愛(ài)。黃酒是以谷物為主要原料釀制成的糧食酒,它不同于白酒,黃酒是沒(méi)有經(jīng)過(guò)蒸餾的,酒精含量較低。黃酒是一種高營(yíng)養(yǎng)性的飲料酒,所以又被譽(yù)為“液體蛋糕”。黃酒中富含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有氨基酸、糖、肽等,其中黃酒中的氨基酸不僅種類高達(dá)20種之多,而且其含量非常豐富,其中人體必需的8種氨基酸含量,居釀造酒之首。黃酒中還含有豐富的人體所必需的微量元素、有機(jī)酸和各種維生素[34]。黃酒除了直接飲用外,還可以入藥,也可以入饌來(lái)去腥增香。黃酒是傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健佳品,目前的初步研究已經(jīng)表明,黃酒具有抗衰老、抗氧化、降膽固醇、降血壓、參與機(jī)體的代謝活動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)等功效[56]。黃酒是一種集飲用與保健為一體的釀造酒,是我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展和扶植的飲料酒之一。我國(guó)從實(shí)行改革開(kāi)放的政策以來(lái),黃酒行業(yè)的發(fā)展速度較快。近年來(lái),由于國(guó)家政策的支持、黃酒企業(yè)積極引導(dǎo)人們消費(fèi),從而黃酒行業(yè)的發(fā)展勢(shì)頭良好,且行業(yè)的整體規(guī)模也穩(wěn)步擴(kuò)大。2006年至2010年, 萬(wàn)千升,合計(jì)增長(zhǎng)110%,年平均復(fù)合增長(zhǎng)率為20%。黃酒行業(yè)龍頭骨干不斷做大做強(qiáng),發(fā)展迅速。,%;,%;,%。2013年18月,全國(guó)規(guī)模以上的黃酒企業(yè)銷售額同比增加8%,利潤(rùn)增加19%左右,較其他酒種相對(duì)穩(wěn)定。但是,目前仍存在著一些問(wèn)題制約著黃酒行業(yè)的快速發(fā)展,如消費(fèi)市場(chǎng)地域性限制沒(méi)有突破導(dǎo)致市場(chǎng)拓展艱難、業(yè)內(nèi)存在著無(wú)序競(jìng)爭(zhēng)從而導(dǎo)致黃酒價(jià)值低估身價(jià)降低、傳統(tǒng)觀念影響從而導(dǎo)致創(chuàng)新能力不夠以及過(guò)分強(qiáng)調(diào)傳統(tǒng)的黃酒釀造技術(shù)從而導(dǎo)致黃酒生產(chǎn)效率難以提高等。隨著人們生活水平和物質(zhì)文化的日益提高,消費(fèi)者對(duì)黃酒產(chǎn)品的品質(zhì)要求也在不斷的提高和變化,包括黃酒的風(fēng)味口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等,特別是消費(fèi)者隨著對(duì)黃酒的認(rèn)識(shí)越來(lái)越高,對(duì)形成其風(fēng)味的微量成分也越來(lái)越重視。傳統(tǒng)的黃酒產(chǎn)品介紹與宣傳已經(jīng)開(kāi)始制約著消費(fèi)群體的進(jìn)一步快速擴(kuò)大,同時(shí)也制約著地域性市場(chǎng)的進(jìn)一步拓展。如何運(yùn)用研究成果來(lái)不斷改進(jìn)黃酒的傳統(tǒng)釀造工藝技術(shù),如何利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)向生產(chǎn)者和消費(fèi)者客觀科學(xué)的介紹黃酒的風(fēng)味物質(zhì),以及進(jìn)一步的改善黃酒的口感和風(fēng)味,達(dá)到吸引更多的消費(fèi)者等,已經(jīng)成為黃酒行業(yè)發(fā)展中重點(diǎn)研究的當(dāng)務(wù)之急。 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述黃酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝賦予了其豐滿、醇和、柔順、圓潤(rùn)、濃郁、悠長(zhǎng)的感覺(jué),也賦予了其醇、香、柔、爽的獨(dú)特風(fēng)味[7]。黃酒這種獨(dú)特的風(fēng)味特征,是眾多風(fēng)味物質(zhì)綜合反應(yīng)的集中體現(xiàn)。黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)種類非常豐富,主要包括醇類、酸類、酯類、醛類及羰基化合物等,其中酸類是黃酒中的重要呈味物質(zhì),而醇類、酯類和醛類則是黃酒香氣的骨架成分,這些風(fēng)味物質(zhì)之間具有風(fēng)味累加、相殺作用或風(fēng)味協(xié)同作用,從而形成了黃酒特有的復(fù)合香[810]。其中,高級(jí)醇和酯類是黃酒中最重要的兩類風(fēng)味物質(zhì),對(duì)促進(jìn)黃酒酒體豐滿、濃厚,并增加酒的協(xié)調(diào)性起著重要作用。 高級(jí)醇對(duì)黃酒風(fēng)味的影響高級(jí)醇通常又被稱為雜醇油,是指具有三個(gè)碳原子以上的一元醇類物質(zhì)的總稱。黃酒中的高級(jí)醇主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、β苯乙醇等[1112],其中含量最高的是異戊醇和異丁醇,其次是正丙醇和苯乙醇[13]。高級(jí)醇是黃酒釀造過(guò)程中不可避免的重要副產(chǎn)物,是構(gòu)成黃酒酒體的重要成分。高級(jí)醇的種類和含量對(duì)黃酒的口感、品質(zhì)有很大的影響,黃酒中所含有的主要高級(jí)醇及其風(fēng)味特征見(jiàn)表11。適宜的高級(jí)醇含量能給人以柔和、醇厚、圓潤(rùn)、豐滿及協(xié)調(diào)的感覺(jué)。所以黃酒中的高級(jí)醇含量不宜過(guò)低或過(guò)高:若過(guò)低,酒味淡,酒體不豐滿;若過(guò)高,不但造成酒體有不愉快的異雜味,還會(huì)有較強(qiáng)的致醉性,也就是人們俗稱的“上頭”[1417]。另外,高級(jí)醇含量過(guò)高對(duì)人體有毒害作用,其毒性會(huì)隨著分子量的增大而加劇。尤其是異戊醇含量過(guò)高時(shí),由于造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血,而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀。黃酒中高級(jí)醇含量?jī)H次于異戊醇的是異丁醇,異丁醇的毒性雖然比異戊醇的毒性小,但是異丁醇含量過(guò)多也會(huì)刺激人的眼、鼻。對(duì)人體粘膜有刺激性作用的正丙醇對(duì)人體生理作用則和乙醇相近。黃酒中高級(jí)醇含量過(guò)高對(duì)人體有毒害作用這一點(diǎn)已經(jīng)引起了消費(fèi)者和生產(chǎn)者的高度重視,而且目前的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示,在所有釀造酒中,黃酒中高級(jí)醇的含量是最高的[18],因此采取安全有效的解決措施,達(dá)到控制黃酒中的高級(jí)醇含量在適宜的范圍內(nèi),對(duì)提高黃酒的品質(zhì)和地位、以及進(jìn)一步擴(kuò)展黃酒市場(chǎng)具有重要意義。表11 黃酒中主要高級(jí)醇及其顯味特征Table 11 Main higher alcohols in yellow rice wine and their characteristics of flavor 高級(jí)醇顯味特征正丙醇刺激的酒精味,似醚臭,有苦味正丁醇較強(qiáng)的乙醇味和微弱的清香感異丁醇有微弱的戊醇味,有苦味感異戊醇雜醇油味,刺舌頭,稍澀,有香蕉味苯乙醇似玫瑰香味,微帶苦澀 酯類對(duì)黃酒風(fēng)味的影響酯類物質(zhì)是黃酒中又一重要的風(fēng)味物質(zhì),對(duì)黃酒的風(fēng)味和品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用,通常具有很強(qiáng)的水果味或花香味。黃酒中的酯類物質(zhì)種類豐富,包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸異戊酯等,其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯,占酯類物質(zhì)總量的85%以上[19]。中低沸點(diǎn)酯類的含量是隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行而不斷增加的,而高級(jí)酯類則增加的非常少,高級(jí)酯大部分產(chǎn)生于黃酒陳釀過(guò)程中,其含量隨著貯存時(shí)間而逐漸升高[7,20]。黃酒中常見(jiàn)的酯類及其所呈現(xiàn)的風(fēng)味特征見(jiàn)表12,由表可知,黃酒中常見(jiàn)酯類對(duì)黃酒風(fēng)味有著正面的作用,所以可以通過(guò)適當(dāng)?shù)奶岣哌@些有著積極作用的酯類的含量,來(lái)進(jìn)一步改善黃酒的品質(zhì)。 表12 黃酒中主要酯類及其顯味特征Table 12 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯類顯味特征乙酸乙酯香蕉、蘋(píng)果香,味辣帶澀,味淡乳酸乙酯香氣弱,味微苦,適量有濃厚感,多則帶澀辛酸乙酯似梨香、菠蘿香,蘋(píng)果味帶甜己酸乙酯似菠蘿香,味甜爽口,大曲酒香,有愉快氣味乙酸異戊酯梨香,香蕉油香,蘋(píng)果味琥珀酸二乙酯微弱并令人愉快的香氣 其他類物質(zhì)對(duì)黃酒風(fēng)味的影響黃酒中的酸是黃酒風(fēng)味中重要的呈味物質(zhì),含酸量過(guò)低,味淡,酒體不協(xié)調(diào);含酸量過(guò)高,會(huì)影響酒體的整體風(fēng)味。黃酒中一些不愉快的味感部分來(lái)自于脂肪酸,所以黃酒中脂肪酸的含量以少一點(diǎn)為好。黃酒中的氨基酸含量豐富,賦予黃酒復(fù)雜的口感。黃酒中含糖量的多少也能夠影響黃酒的品質(zhì),黃酒中含有一定量的糖能夠賦予酒體醇厚感和愉快感,而含糖量過(guò)低的酒,其口感往往會(huì)比較粗糙。 黃酒發(fā)酵過(guò)程中高級(jí)醇的形成與控制 高級(jí)醇的形成機(jī)理研究表明,在釀酒過(guò)程的主發(fā)酵期間,酵母菌的生長(zhǎng)繁殖伴隨著高級(jí)醇的生成,80%的高級(jí)醇是在這段時(shí)間逐漸形成的[21],酵母生成高級(jí)醇的代謝途徑有兩個(gè)(圖11):一是分解代謝途徑即Ehrlich途徑,由氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑生成α酮酸[2223],α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級(jí)醇;二是糖代謝途徑即Harris途徑,由葡萄糖經(jīng)過(guò)EMP途徑以及TCA循環(huán)生成α酮酸[2425],α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級(jí)醇。在正常發(fā)酵液中生成的高級(jí)醇總量,75%是由糖代謝產(chǎn)生的,另外25%來(lái)源于Ehrlich途徑[2627]。圖11 高級(jí)醇合成途徑 Synthesis pathway of higher alcohols 分解代謝途徑(Ehrlich代謝機(jī)制)1907年,德國(guó)化學(xué)家Ehrlich[28]最早提出了由氨基酸的分解代謝形成高級(jí)醇的途徑。1911年,Neubauer[29]等人對(duì)Ehrlich代謝途徑進(jìn)行了進(jìn)一步的補(bǔ)充,即推斷a酮酸是高級(jí)醇代謝過(guò)程中重要的中間代謝產(chǎn)物,a酮酸經(jīng)脫羧轉(zhuǎn)化成醛,醛再進(jìn)一步還原為相應(yīng)的高級(jí)醇。隨后,Lampitt[30],Yamada[31],Thorne[3233],Ingraham[34]等進(jìn)一步研究證實(shí)氨基酸的分解代謝生成各種高級(jí)醇。Ehrlich代謝機(jī)制隨著其后研究的不斷完善,現(xiàn)在可歸納為:釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中,氨基酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨作用將氨基轉(zhuǎn)移到α酮戊二酸上形成谷氨酸和α酮酸,α酮酸在脫羧酶催化作用下,經(jīng)脫羧成醛,醛再經(jīng)醇脫氫酶作用下還原為相應(yīng)的高級(jí)醇,反應(yīng)過(guò)程如圖12所示[3536]。圖12 Ehrlich代謝途徑 Ehrlich pathway根據(jù)此反應(yīng)機(jī)制,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等都可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的高級(jí)醇。各種氨基酸與相應(yīng)的高級(jí)醇之間的關(guān)系見(jiàn)表13。表13 氨基酸代謝產(chǎn)物與其相應(yīng)的高級(jí)醇Table 13 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol氨基酸α酮酸高級(jí)醇亮氨酸α異己酸異戊醇異亮氨酸α酮基β甲基戊酸活性戊醇纈氨酸α酮基異戊酸異丁醇蘇氨酸α酮基丁酸丙醇苯丙氨酸3苯基2酮基丙酸苯丙醇 合成代謝途徑(Harris途徑)經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究得知,氨基酸分解代謝途徑并不是高級(jí)醇生成的唯一途徑,主要依據(jù)可以歸納為以下幾點(diǎn):(1)在合成培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵時(shí),培養(yǎng)基中加入的氨基酸種類與生成的高級(jí)醇種類不具有相關(guān)性;(2)高級(jí)醇的生成速率與乙醇的形成速率相平行,與培養(yǎng)基中氨基酸含量的高低無(wú)關(guān);(3)酵母在含有單一氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí),仍能形成各種高級(jí)醇;(4)高級(jí)醇中的某些組成(如正丁醇,其相應(yīng)的氨基酸為纈氨酸)在自然界中并不存在。Harris于1953年提出了高級(jí)醇由糖代謝通過(guò)丙酮酸的合成途徑[37]。Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高級(jí)醇[38],即合成代謝途徑:糖類提供合成氨基酸的碳骨架,然后在合成代謝的最后階段形成α酮酸中間體,α酮酸中間體經(jīng)脫羧和還原形成相應(yīng)的高級(jí)醇[39]。Webb[40]和Ingraham[34,4142]于1963年,共同提出了異丁醇的糖代謝合成途徑。此后的研究中,正丙醇、異戊醇和活性戊醇的合成代謝途徑也陸續(xù)被提出并最終得到證明,總的反應(yīng)途徑如圖13所示。圖13 Harris途徑 Harris pathway 影響黃酒中高級(jí)醇含量的主要因素影響黃酒中高級(jí)醇含量的因素有很多,如原輔料的成分及比例、發(fā)酵工藝的控制、酵母菌種及黃酒后處理工藝等,這些因素相互作用,共同決定黃酒中的高級(jí)醇含量[43]。 黃酒釀造原輔料黃酒發(fā)酵過(guò)程中,原料及微生物中蛋白質(zhì)的分解是氨基酸的主要來(lái)源。原輔料中含有豐富的蛋白質(zhì),主要包括釀造用米和制曲用小麥等,這些物質(zhì)為黃酒釀造提供了大量的蛋白質(zhì)。黃酒釀造過(guò)程中的微生物數(shù)量多且種類廣,除了酵母菌,還包括細(xì)菌、霉菌等,這些微生物死亡后自溶于發(fā)酵醪液中,也會(huì)提供豐富的蛋白質(zhì)[44]。 在整個(gè)黃酒釀造過(guò)程中,氨基酸的含量是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,其原因主要為以下兩個(gè)方面:一是酵母菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖需要消耗氨基酸,二是在蛋白酶的作用下蛋白質(zhì)可以不斷水解為氨基酸。由于發(fā)酵醪中存在過(guò)量的氨基酸時(shí)會(huì)通過(guò)分解代謝途徑轉(zhuǎn)化
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