【正文】 天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響畢業(yè)論文目 錄1 前 言 1 黃酒概述 1 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述 1 高級醇對黃酒風(fēng)味的影響 2 酯類對黃酒風(fēng)味的影響 3 其他類物質(zhì)對黃酒風(fēng)味的影響 3 黃酒發(fā)酵過程中高級醇的形成與控制 3 高級醇的形成機理 3 影響黃酒中高級醇含量的主要因素 6 降低黃酒中高級醇含量的主要措施 7 低產(chǎn)高級醇酵母菌株的研究進(jìn)展 8 誘變育種 8 細(xì)胞融合育種 9 基因工程育種 9 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容 10 10 本課題的主要研究內(nèi)容 112 材料與方法 13 材料與儀器 13 主要試劑 13 主要實驗儀器 14 菌種與質(zhì)粒 15 主要培養(yǎng)基 15 主要溶液 16 分析方法 17 CO2失重的測定 17 酒精度的測定 17 還原糖的測定 17 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測定 18 生長曲線的測定 18 實驗方法 19 引物設(shè)計 19 各目的基因片段的獲得 21 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 23 酵母轉(zhuǎn)化 25 G418抗性基因的去除 26 黃酒發(fā)酵實驗 263 結(jié)果與討論 28 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 28 BAT1基因的驗證 28 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 28 BAT1基因敲除突變株的獲得及驗證 30 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 32 小結(jié)與討論 33 BATBAT2基因雙敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 33 BATBAT2基因雙敲除突變株的獲得及驗證 33 突變株與出發(fā)菌株生長性能的比較 34 BATBAT2基因雙敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 35 小結(jié)與討論 36 HOM2基因一個等位基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 37 HOM2基因的驗證 37 重組質(zhì)粒pUCHABK的構(gòu)建 38 HOM2基因一個等位基因敲除的突變株的獲得及驗證 40 HOM2基因一個等位基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 41 遺傳標(biāo)記基因KanMX的去除 42 小結(jié)與討論 44 HOM2基因兩個等位基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 44 重組質(zhì)粒pUCHB1A1K的構(gòu)建 44 HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株的獲得及驗證 47 突變株與出發(fā)菌株生長性能的比較 48 HOM2基因兩個等位基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 49 小結(jié)與討論 504 結(jié) 論 515 展 望 526 參考文獻(xiàn) 537 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況 588 致 謝 591 前 言 黃酒概述黃酒是我國的民族特產(chǎn)，至今已經(jīng)有7千年的歷史，與啤酒、葡萄酒并稱為世界上三大最古老的釀造酒[1]。黃酒由于具有悠久的歷史、豐富的營養(yǎng)、獨特的風(fēng)味、酒精度低等特點[2]，所以受到廣大人民群眾的喜愛。黃酒是以谷物為主要原料釀制成的糧食酒，它不同于白酒，黃酒是沒有經(jīng)過蒸餾的，酒精含量較低。黃酒是一種高營養(yǎng)性的飲料酒，所以又被譽為“液體蛋糕”。黃酒中富含的營養(yǎng)物質(zhì)有氨基酸、糖、肽等，其中黃酒中的氨基酸不僅種類高達(dá)20種之多，而且其含量非常豐富，其中人體必需的8種氨基酸含量，居釀造酒之首。黃酒中還含有豐富的人體所必需的微量元素、有機酸和各種維生素[34]。黃酒除了直接飲用外，還可以入藥，也可以入饌來去腥增香。黃酒是傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健佳品，目前的初步研究已經(jīng)表明，黃酒具有抗衰老、抗氧化、降膽固醇、降血壓、參與機體的代謝活動和免疫調(diào)節(jié)等功效[56]。黃酒是一種集飲用與保健為一體的釀造酒，是我國重點發(fā)展和扶植的飲料酒之一。我國從實行改革開放的政策以來，黃酒行業(yè)的發(fā)展速度較快。近年來，由于國家政策的支持、黃酒企業(yè)積極引導(dǎo)人們消費，從而黃酒行業(yè)的發(fā)展勢頭良好，且行業(yè)的整體規(guī)模也穩(wěn)步擴大。2006年至2010年， 萬千升，合計增長110%，年平均復(fù)合增長率為20%。黃酒行業(yè)龍頭骨干不斷做大做強，發(fā)展迅速。，%；，%；，%。2013年18月，全國規(guī)模以上的黃酒企業(yè)銷售額同比增加8%，利潤增加19%左右，較其他酒種相對穩(wěn)定。但是，目前仍存在著一些問題制約著黃酒行業(yè)的快速發(fā)展，如消費市場地域性限制沒有突破導(dǎo)致市場拓展艱難、業(yè)內(nèi)存在著無序競爭從而導(dǎo)致黃酒價值低估身價降低、傳統(tǒng)觀念影響從而導(dǎo)致創(chuàng)新能力不夠以及過分強調(diào)傳統(tǒng)的黃酒釀造技術(shù)從而導(dǎo)致黃酒生產(chǎn)效率難以提高等。隨著人們生活水平和物質(zhì)文化的日益提高，消費者對黃酒產(chǎn)品的品質(zhì)要求也在不斷的提高和變化，包括黃酒的風(fēng)味口感和營養(yǎng)價值等，特別是消費者隨著對黃酒的認(rèn)識越來越高，對形成其風(fēng)味的微量成分也越來越重視。傳統(tǒng)的黃酒產(chǎn)品介紹與宣傳已經(jīng)開始制約著消費群體的進(jìn)一步快速擴大，同時也制約著地域性市場的進(jìn)一步拓展。如何運用研究成果來不斷改進(jìn)黃酒的傳統(tǒng)釀造工藝技術(shù)，如何利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)向生產(chǎn)者和消費者客觀科學(xué)的介紹黃酒的風(fēng)味物質(zhì)，以及進(jìn)一步的改善黃酒的口感和風(fēng)味，達(dá)到吸引更多的消費者等，已經(jīng)成為黃酒行業(yè)發(fā)展中重點研究的當(dāng)務(wù)之急。 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述黃酒獨特的生產(chǎn)工藝賦予了其豐滿、醇和、柔順、圓潤、濃郁、悠長的感覺，也賦予了其醇、香、柔、爽的獨特風(fēng)味[7]。黃酒這種獨特的風(fēng)味特征，是眾多風(fēng)味物質(zhì)綜合反應(yīng)的集中體現(xiàn)。黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)種類非常豐富，主要包括醇類、酸類、酯類、醛類及羰基化合物等，其中酸類是黃酒中的重要呈味物質(zhì)，而醇類、酯類和醛類則是黃酒香氣的骨架成分，這些風(fēng)味物質(zhì)之間具有風(fēng)味累加、相殺作用或風(fēng)味協(xié)同作用，從而形成了黃酒特有的復(fù)合香[810]。其中，高級醇和酯類是黃酒中最重要的兩類風(fēng)味物質(zhì)，對促進(jìn)黃酒酒體豐滿、濃厚，并增加酒的協(xié)調(diào)性起著重要作用。 高級醇對黃酒風(fēng)味的影響高級醇通常又被稱為雜醇油，是指具有三個碳原子以上的一元醇類物質(zhì)的總稱。黃酒中的高級醇主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、β苯乙醇等[1112]，其中含量最高的是異戊醇和異丁醇，其次是正丙醇和苯乙醇[13]。高級醇是黃酒釀造過程中不可避免的重要副產(chǎn)物，是構(gòu)成黃酒酒體的重要成分。高級醇的種類和含量對黃酒的口感、品質(zhì)有很大的影響，黃酒中所含有的主要高級醇及其風(fēng)味特征見表11。適宜的高級醇含量能給人以柔和、醇厚、圓潤、豐滿及協(xié)調(diào)的感覺。所以黃酒中的高級醇含量不宜過低或過高：若過低，酒味淡，酒體不豐滿；若過高，不但造成酒體有不愉快的異雜味，還會有較強的致醉性，也就是人們俗稱的“上頭”[1417]。另外，高級醇含量過高對人體有毒害作用，其毒性會隨著分子量的增大而加劇。尤其是異戊醇含量過高時，由于造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血，而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀。黃酒中高級醇含量僅次于異戊醇的是異丁醇，異丁醇的毒性雖然比異戊醇的毒性小，但是異丁醇含量過多也會刺激人的眼、鼻。對人體粘膜有刺激性作用的正丙醇對人體生理作用則和乙醇相近。黃酒中高級醇含量過高對人體有毒害作用這一點已經(jīng)引起了消費者和生產(chǎn)者的高度重視，而且目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的[18]，因此采取安全有效的解決措施，達(dá)到控制黃酒中的高級醇含量在適宜的范圍內(nèi)，對提高黃酒的品質(zhì)和地位、以及進(jìn)一步擴展黃酒市場具有重要意義。表11 黃酒中主要高級醇及其顯味特征Table 11 Main higher alcohols in yellow rice wine and their characteristics of flavor 高級醇顯味特征正丙醇刺激的酒精味，似醚臭，有苦味正丁醇較強的乙醇味和微弱的清香感異丁醇有微弱的戊醇味，有苦味感異戊醇雜醇油味，刺舌頭，稍澀，有香蕉味苯乙醇似玫瑰香味，微帶苦澀 酯類對黃酒風(fēng)味的影響酯類物質(zhì)是黃酒中又一重要的風(fēng)味物質(zhì)，對黃酒的風(fēng)味和品質(zhì)起著關(guān)鍵性的作用，通常具有很強的水果味或花香味。黃酒中的酯類物質(zhì)種類豐富，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸異戊酯等，其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯，占酯類物質(zhì)總量的85%以上[19]。中低沸點酯類的含量是隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行而不斷增加的，而高級酯類則增加的非常少，高級酯大部分產(chǎn)生于黃酒陳釀過程中，其含量隨著貯存時間而逐漸升高[7,20]。黃酒中常見的酯類及其所呈現(xiàn)的風(fēng)味特征見表12，由表可知，黃酒中常見酯類對黃酒風(fēng)味有著正面的作用，所以可以通過適當(dāng)?shù)奶岣哌@些有著積極作用的酯類的含量，來進(jìn)一步改善黃酒的品質(zhì)。 表12 黃酒中主要酯類及其顯味特征Table 12 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯類顯味特征乙酸乙酯香蕉、蘋果香，味辣帶澀，味淡乳酸乙酯香氣弱，味微苦，適量有濃厚感，多則帶澀辛酸乙酯似梨香、菠蘿香，蘋果味帶甜己酸乙酯似菠蘿香，味甜爽口，大曲酒香，有愉快氣味乙酸異戊酯梨香，香蕉油香，蘋果味琥珀酸二乙酯微弱并令人愉快的香氣 其他類物質(zhì)對黃酒風(fēng)味的影響黃酒中的酸是黃酒風(fēng)味中重要的呈味物質(zhì)，含酸量過低，味淡，酒體不協(xié)調(diào)；含酸量過高，會影響酒體的整體風(fēng)味。黃酒中一些不愉快的味感部分來自于脂肪酸，所以黃酒中脂肪酸的含量以少一點為好。黃酒中的氨基酸含量豐富，賦予黃酒復(fù)雜的口感。黃酒中含糖量的多少也能夠影響黃酒的品質(zhì)，黃酒中含有一定量的糖能夠賦予酒體醇厚感和愉快感，而含糖量過低的酒，其口感往往會比較粗糙。 黃酒發(fā)酵過程中高級醇的形成與控制 高級醇的形成機理研究表明，在釀酒過程的主發(fā)酵期間，酵母菌的生長繁殖伴隨著高級醇的生成，80%的高級醇是在這段時間逐漸形成的[21]，酵母生成高級醇的代謝途徑有兩個(圖11)：一是分解代謝途徑即Ehrlich途徑，由氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑生成α酮酸[2223]，α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級醇；二是糖代謝途徑即Harris途徑，由葡萄糖經(jīng)過EMP途徑以及TCA循環(huán)生成α酮酸[2425],α酮酸經(jīng)脫羧再脫氫生成高級醇。在正常發(fā)酵液中生成的高級醇總量，75%是由糖代謝產(chǎn)生的，另外25%來源于Ehrlich途徑[2627]。圖11 高級醇合成途徑 Synthesis pathway of higher alcohols 分解代謝途徑（Ehrlich代謝機制）1907年，德國化學(xué)家Ehrlich[28]最早提出了由氨基酸的分解代謝形成高級醇的途徑。1911年，Neubauer[29]等人對Ehrlich代謝途徑進(jìn)行了進(jìn)一步的補充，即推斷a酮酸是高級醇代謝過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，a酮酸經(jīng)脫羧轉(zhuǎn)化成醛，醛再進(jìn)一步還原為相應(yīng)的高級醇。隨后，Lampitt[30]，Yamada[31]，Thorne[3233]，Ingraham[34]等進(jìn)一步研究證實氨基酸的分解代謝生成各種高級醇。Ehrlich代謝機制隨著其后研究的不斷完善，現(xiàn)在可歸納為：釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中，氨基酸通過轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨作用將氨基轉(zhuǎn)移到α酮戊二酸上形成谷氨酸和α酮酸，α酮酸在脫羧酶催化作用下，經(jīng)脫羧成醛，醛再經(jīng)醇脫氫酶作用下還原為相應(yīng)的高級醇，反應(yīng)過程如圖12所示[3536]。圖12 Ehrlich代謝途徑 Ehrlich pathway根據(jù)此反應(yīng)機制，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等都可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的高級醇。各種氨基酸與相應(yīng)的高級醇之間的關(guān)系見表13。表13 氨基酸代謝產(chǎn)物與其相應(yīng)的高級醇Table 13 Amino acid metabolite and its corresponding higher alcohol氨基酸α酮酸高級醇亮氨酸α異己酸異戊醇異亮氨酸α酮基β甲基戊酸活性戊醇纈氨酸α酮基異戊酸異丁醇蘇氨酸α酮基丁酸丙醇苯丙氨酸3苯基2酮基丙酸苯丙醇 合成代謝途徑（Harris途徑）經(jīng)過進(jìn)一步研究得知，氨基酸分解代謝途徑并不是高級醇生成的唯一途徑，主要依據(jù)可以歸納為以下幾點：（1）在合成培養(yǎng)基中進(jìn)行酒精發(fā)酵時，培養(yǎng)基中加入的氨基酸種類與生成的高級醇種類不具有相關(guān)性；（2）高級醇的生成速率與乙醇的形成速率相平行，與培養(yǎng)基中氨基酸含量的高低無關(guān)；（3）酵母在含有單一氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時，仍能形成各種高級醇；（4）高級醇中的某些組成（如正丁醇，其相應(yīng)的氨基酸為纈氨酸）在自然界中并不存在。Harris于1953年提出了高級醇由糖代謝通過丙酮酸的合成途徑[37]。Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高級醇[38]，即合成代謝途徑：糖類提供合成氨基酸的碳骨架，然后在合成代謝的最后階段形成α酮酸中間體，α酮酸中間體經(jīng)脫羧和還原形成相應(yīng)的高級醇[39]。Webb[40]和Ingraham[34,4142]于1963年，共同提出了異丁醇的糖代謝合成途徑。此后的研究中，正丙醇、異戊醇和活性戊醇的合成代謝途徑也陸續(xù)被提出并最終得到證明，總的反應(yīng)途徑如圖13所示。圖13 Harris途徑 Harris pathway 影響黃酒中高級醇含量的主要因素影響黃酒中高級醇含量的因素有很多，如原輔料的成分及比例、發(fā)酵工藝的控制、酵母菌種及黃酒后處理工藝等，這些因素相互作用，共同決定黃酒中的高級醇含量[43]。 黃酒釀造原輔料黃酒發(fā)酵過程中，原料及微生物中蛋白質(zhì)的分解是氨基酸的主要來源。原輔料中含有豐富的蛋白質(zhì)，主要包括釀造用米和制曲用小麥等，這些物質(zhì)為黃酒釀造提供了大量的蛋白質(zhì)。黃酒釀造過程中的微生物數(shù)量多且種類廣，除了酵母菌，還包括細(xì)菌、霉菌等，這些微生物死亡后自溶于發(fā)酵醪液中，也會提供豐富的蛋白質(zhì)[44]。 在整個黃酒釀造過程中，氨基酸的含量是一個動態(tài)過程，其原因主要為以下兩個方面：一是酵母菌等微生物的生長繁殖需要消耗氨基酸，二是在蛋白酶的作用下蛋白質(zhì)可以不斷水解為氨基酸。由于發(fā)酵醪中存在過量的氨基酸時會通過分解代謝途徑轉(zhuǎn)化