【正文】 豐富的人體所必需的微量元素、有機(jī)酸和各種維生素[34]。我國從實(shí)行改革開放的政策以來，黃酒行業(yè)的發(fā)展速度較快。%；，%；，%。傳統(tǒng)的黃酒產(chǎn)品介紹與宣傳已經(jīng)開始制約著消費(fèi)群體的進(jìn)一步快速擴(kuò)大，同時(shí)也制約著地域性市場的進(jìn)一步拓展。黃酒中的風(fēng)味物質(zhì)種類非常豐富，主要包括醇類、酸類、酯類、醛類及羰基化合物等，其中酸類是黃酒中的重要呈味物質(zhì)，而醇類、酯類和醛類則是黃酒香氣的骨架成分，這些風(fēng)味物質(zhì)之間具有風(fēng)味累加、相殺作用或風(fēng)味協(xié)同作用，從而形成了黃酒特有的復(fù)合香[810]。高級醇是黃酒釀造過程中不可避免的重要副產(chǎn)物，是構(gòu)成黃酒酒體的重要成分。另外，高級醇含量過高對人體有毒害作用，其毒性會(huì)隨著分子量的增大而加劇。黃酒中高級醇含量過高對人體有毒害作用這一點(diǎn)已經(jīng)引起了消費(fèi)者和生產(chǎn)者的高度重視，而且目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的[18]，因此采取安全有效的解決措施，達(dá)到控制黃酒中的高級醇含量在適宜的范圍內(nèi)，對提高黃酒的品質(zhì)和地位、以及進(jìn)一步擴(kuò)展黃酒市場具有重要意義。黃酒中常見的酯類及其所呈現(xiàn)的風(fēng)味特征見表12，由表可知，黃酒中常見酯類對黃酒風(fēng)味有著正面的作用，所以可以通過適當(dāng)?shù)奶岣哌@些有著積極作用的酯類的含量，來進(jìn)一步改善黃酒的品質(zhì)。黃酒中含糖量的多少也能夠影響黃酒的品質(zhì)，黃酒中含有一定量的糖能夠賦予酒體醇厚感和愉快感，而含糖量過低的酒，其口感往往會(huì)比較粗糙。1911年，Neubauer[29]等人對Ehrlich代謝途徑進(jìn)行了進(jìn)一步的補(bǔ)充，即推斷a酮酸是高級醇代謝過程中重要的中間代謝產(chǎn)物，a酮酸經(jīng)脫羧轉(zhuǎn)化成醛，醛再進(jìn)一步還原為相應(yīng)的高級醇。各種氨基酸與相應(yīng)的高級醇之間的關(guān)系見表13。Webb[40]和Ingraham[34,4142]于1963年，共同提出了異丁醇的糖代謝合成途徑。原輔料中含有豐富的蛋白質(zhì)，主要包括釀造用米和制曲用小麥等，這些物質(zhì)為黃酒釀造提供了大量的蛋白質(zhì)。 碳氮比這里的氮源主要是指氨基酸態(tài)氮，在黃酒釀造過程中，當(dāng)醪液中氨基酸含量較低時(shí)，不能滿足酵母菌的生長繁殖需要，酵母菌就會(huì)通過Harris途徑合成其所需要的氨基酸，這樣就會(huì)形成較多的α酮酸，并經(jīng)過脫羧和還原形成高級醇；當(dāng)醪液中氨基酸含量較高時(shí)，酵母的生長繁殖增加，從而也會(huì)導(dǎo)致生成的高級醇含量增加，而且某些特定的的氨基酸也可以通過Ehrlich代謝途徑轉(zhuǎn)化形成相應(yīng)的高級醇[45]。酵母菌要合成那些不能被自身同化的氨基酸時(shí)，由糖代謝途徑提供所需要的酮酸，而α氨基氮來自于能被酵母快速同化的8種氨基酸（經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶脫下）。由于高級醇是酵母生長繁殖過程中合成自身細(xì)胞蛋白時(shí)的副產(chǎn)物，所以高級醇的生成是不可避免的，但是高級醇的生成量又是可以控制的，從理論上說，高級醇的生成量會(huì)隨著酵母細(xì)胞增殖倍數(shù)的增加而增加，所以合理適當(dāng)?shù)募哟蠼湍妇慕臃N量可以減少其增殖倍數(shù)，由此也相應(yīng)的減少了高級醇的生成量[47]。所以通過降低發(fā)酵末期的溫度，抑制酵母菌的活動(dòng)能力，可以降低高級醇生成量。 其他等因素周天銀等[50]研究發(fā)現(xiàn)，糖化酶的添加量會(huì)影響高級醇的生成，并且這一點(diǎn)已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了實(shí)踐。在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵醪中酵母細(xì)胞的總數(shù)控制在一定范圍內(nèi)，使其發(fā)酵力、糖化力及蛋白分解力三者達(dá)到平衡協(xié)調(diào)時(shí)，則能夠更有效的降低高級醇的含量。 優(yōu)化黃酒發(fā)酵工藝選用蛋白質(zhì)含量低的黃酒生產(chǎn)用原料，并提高原料的精白度，以去除部分原料表皮中所含有的蛋白質(zhì)。適當(dāng)增加酵母接種量并嚴(yán)格控制發(fā)酵醪中的溶氧。（2）通過通風(fēng)處理、熱處理等一些理化手段[54]，能夠加速酒體中高級醇成酯成酸的生化反應(yīng)，從而不但降低了酒體中高級醇的含量，而且形成了能夠提高黃酒品質(zhì)的風(fēng)味物質(zhì)。有多種方法可以對釀酒酵母進(jìn)行誘變處理，其中普遍采用的物理誘變方法為紫外線誘變，化學(xué)誘變方法有亞硝酸誘變、亞硝基胍誘變等。王鵬銀[56]等人利用N+離子注入技術(shù)誘變并篩選到了一株亮氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株A713，%，%。首先，誘變育種得到的菌株大多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型菌株，在其發(fā)酵過程中要向發(fā)酵液中補(bǔ)加維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，所以不利于工業(yè)化生產(chǎn)。王芬[59]等將發(fā)酵度高、產(chǎn)乙醛量低，但產(chǎn)高級醇含量高的菌株NW745與發(fā)酵度不高但產(chǎn)高級醇量少的菌株JW11進(jìn)行融合反應(yīng)，選育出了發(fā)酵度高且產(chǎn)高級醇量低的優(yōu)良菌株DR92。結(jié)合酵母中高級醇生成的兩條代謝途徑，許多科學(xué)家對降低釀酒酵母生成高級醇的含量，尤其是降低其生成異丁醇和異戊醇的含量進(jìn)行了大量且深入的研究。Eden[21]等人的研究結(jié)果表明，敲除BAT1基因或者敲除BAT2基因時(shí)，都基本沒有影響正丙醇的生成量，但敲除BAT2基因?qū)Ξ惗〈己彤愇齑嫉纳闪坑休^大的影響。丙酮酸脫羧酶是氨基酸分解代謝途徑中催化α酮酸脫羧成醛的關(guān)鍵酶，Yoshimoto[66]等人構(gòu)建了編碼丙酮酸脫羧酶的PDC1基因缺失的突變株，其異戊醇的生成量下降了31%。 醇乙?；D(zhuǎn)移酶對高級醇生成量的影響Yoshimoto[63]等人構(gòu)建的過表達(dá)ATF1的菌株，其發(fā)酵生成異戊醇和異丁醇的含量分別降低了74%和52%；Fukuda[72]等人構(gòu)建的同時(shí)過表達(dá)ATF1和ATF2的菌株，不但提高了菌株乙酸酯合成酶的活力，而且還顯著降低了異戊醇的生成量；本實(shí)驗(yàn)室張建煒[73]等人構(gòu)建的過量表達(dá)ATF1的菌株，其生成異戊醇的含量下降了50%。目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的。釀酒酵母生成高級醇的兩條代謝途徑是在眾多酶的催化作用下完成的，這些酶分別是由一個(gè)或一系列相關(guān)基因編碼的，為確定影響高級醇代謝途徑的關(guān)鍵基因，本實(shí)驗(yàn)擬采用基因工程育種手段，敲除某些直接或間接參與高級醇代謝途徑的酶的編碼基因，研究基因敲除對高級醇生成量的影響。 本課題的主要研究內(nèi)容本課題擬從以下幾個(gè)方面展開研究：（1）BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。（3）HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHB1A1K，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HA1KanMXHB1導(dǎo)入HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株中，篩選得到HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株與HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株及二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究HOM2基因兩個(gè)等位基因的敲除對黃酒酵母二倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。（2）YEPD培養(yǎng)基（w/v）葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。（5）黃酒發(fā)酵培養(yǎng)基500 mL三角瓶中加入100 g大米（蒸熟并攤涼），10 g麥曲，45 mL米漿水（PH ），60 mL清水，30 mL二級種子液。（3）斐林乙液分別稱取50 g酒石酸鉀鈉，54 g氫氧化鈉，以及4 g亞鐵氰化鉀，用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（7）50TAE緩沖液分別取242 gTris， mL冰醋酸，和100 mL mol/L的Na2EDTA（pH ），然后用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（11）20%乙醇溶液量取20 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。 酒精度的測定利用酒精計(jì)比重法測定酒精度[74]。蒸餾結(jié)束后用酒精計(jì)測定蒸餾液酒精度，同時(shí)用溫度計(jì)測量蒸餾液的溫度，最后將該溫度下測定的酒精度換算成20℃條件下的酒精度。在電爐上加熱至沸騰，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定直至藍(lán)色消失，此滴定操作過程要求操作準(zhǔn)確并且迅速，需要在1 min以內(nèi)完成，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積。進(jìn)樣口的溫度為 220℃，檢測器的溫度為250℃。（2）樣品預(yù)處理 mL至10 mL容量瓶中，并用發(fā)酵液蒸餾所得酒樣定容，混勻后， mL加入到自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，然后進(jìn)行氣相分析。根據(jù)各物質(zhì)的峰面積用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)一步定量計(jì)算各物質(zhì)的含量。 實(shí)驗(yàn)方法 引物設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)中所用全部引物序列見表24。在BA片段的上游設(shè)計(jì)引物BS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計(jì)引物KSBAT1用于BAT1基因單敲除突變株的上游驗(yàn)證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物KXBAT1和在BB片段的下游設(shè)計(jì)引物BX用于BAT1基因單敲除突變株的下游驗(yàn)證。在HA片段的上游設(shè)計(jì)引物HS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計(jì)引物KS1用于HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株的上游驗(yàn)證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物KX1和在HB片段的下游設(shè)計(jì)引物HX用于HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株的下游驗(yàn)證。其操作步驟如下:（1）取斜面酵母菌種一環(huán)于裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。（5）然后加入20 μL（10 mg/mL）的蛋白酶K，并充分顛倒混勻，在65℃水浴中消化15~30min，消化期間可以顛倒混勻數(shù)次，直到樣品完全消化為止。（9）向吸附柱中加入500 μL漂洗液，12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。 各基因片段的PCR擴(kuò)增（1）PCR反應(yīng)體系加樣量如表25。 表26 PCR反應(yīng)條件Table 26 Reaction conditions of PCR 步驟溫度時(shí)間預(yù)變性95℃5 min變性94℃40 s退火X℃1 min延伸72℃13 min終延伸72℃10 min 注：X與引物有關(guān)，一般比其Tm值小5 ℃~10 ℃ 變性至延伸部分共循環(huán)30次，退火溫度X由各目的基因片段的引物情況決定。（3）室溫條件下放置30~45 min，直到瓊脂糖溶液完全凝固，小心地拔出梳子后，將凝膠放置于電泳槽中。（7）根據(jù)上樣緩沖液遷移的位置判斷是否終止電泳，切斷電源，取出凝膠后放于EB溶液中，浸泡時(shí)間約為10 min；（8）從EB溶液中取出凝膠后放入凝膠成像系統(tǒng)中檢測電泳結(jié)果，并保存電泳圖片。 （3）12000 rpm離心1 min后，倒掉收集管中的廢液。 （7）將吸附柱置于新的離心管中，加入20～100μL洗脫液，靜置2 min。4）將菌液立即放置于冰上預(yù)冷10 min，4℃，5000 rpm離心5 min，棄除上清，收集大腸桿菌的菌體沉淀。8） mL EP管分裝，100 μL/管。3）冰浴后42℃熱激90 s，并迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2 min。2） mL的EP管中，12000 rpm離心1 min。（2）采用solarbio質(zhì)粒小提試劑盒精提。4）向EP管中加入350 μL溶液III，并馬上溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次以充分混勻，此時(shí)將會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，然后12000 rpm離心10 min。8）12000 rpm空甩2 min，丟掉收集管，并將吸附柱敞口放置于室溫下數(shù)分鐘。 質(zhì)粒載體和目的片段的酶切質(zhì)粒和目的片段的酶切體系如表27：表27 酶切體系Table 27 Components of enzyme digestion system組分加樣量10Buffer 10 μL質(zhì)粒≤ 2 μg酶2 μLddH2OAdd to 40 μL反應(yīng)條件為37℃（或30℃）水浴3~4 h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 質(zhì)粒載體與目的片段的連接 質(zhì)粒載體與目的片段進(jìn)行連接的體系見表29：表29 連接體系Table 29 Components of ligation system組分加樣量載體DNAx μL目的片段y μLSolution I5 μL反應(yīng)條件：載體與目的片段的摩爾比為1:31:10，16℃恒溫條件下連接過夜。5）離心，棄除上清， mL的LiAc/TE緩沖液重新懸浮，每管50 μL進(jìn)行分裝，離心后，用移液槍小心吸除上清，并立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化。5）42℃水浴中熱激40 min。首先利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pGAPza轉(zhuǎn)入酵母中，然后通過半乳糖誘導(dǎo)后，稀釋涂布于無抗性的YEPD平板。（3）二級種子培養(yǎng)：取一級種子液2 mL接種到裝有100 mL麥汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，30℃靜置培養(yǎng)24 h。圖31 BAT1基因的PCR產(chǎn)物 PCR production of BAT1M：DL5000 DNA Marker；1：BAT1 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 目的片段的擴(kuò)增以黃酒酵母基因組為模板，利用引物BAU和BAD擴(kuò)增BAT1基因上游的BA片段，利用引物BBU和BBD擴(kuò)增BAT1基因下游的BB片段, 以質(zhì)粒pUG6為模板，利用引物KanU和KanD擴(kuò)增KanMX基因片段，電泳檢測擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖32所示。將KanMX基因片段用BamHI進(jìn)行單酶切，與經(jīng)同樣酶切并去磷酸化回收的pUCBAB質(zhì)粒連接，最終構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一，特異性條帶大小正確。圖36 BAKanMXBB片段與黃酒酵母基因組同源重組過程 Double homologous rebination between BAKanMXBB cassette and BAT1 gene in yellow wine yeast挑取G418平板上長出的轉(zhuǎn)化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并提取其基因組，然后以此基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。表31 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 31 Basic fermentation performances of BAT1 mutant strains and parent strains菌株CO2累計(jì)失重 （g） 酒度（%，v/v）殘?zhí)牵╣/100 mL）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3? g，結(jié)果均與出發(fā)菌株接近，同時(shí)殘?zhí)橇恳捕嫉陀? g/100mL，表示BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵均很徹底