【正文】 .......... 14 致 謝 ............................................................................................................................. 17 外文文獻(xiàn)翻譯 ............................................................................................................... 18 1 1 前言 鉬 鉬 (Molybdenum， Mo)相對原子質(zhì)量： ，原子序數(shù)為 42。適量增加鉬的攝 人可以減少心血管疾病、食道癌及乳腺癌的發(fā)生，但攝食過量會引起動物機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生銅缺乏，進(jìn)而導(dǎo)致鉬中毒 [1]。導(dǎo)致貧血、心臟肥大、骨變形、主動脈瘤、肌肉間出血、毛發(fā)褪色、脊 髓的脫鞘髓。近些年來，鉬制劑作為飼料添加劑被 廣泛應(yīng)用于動物生產(chǎn)，由此所造成的奶牛鉬中毒事件屢有發(fā)生 。吳茂江在研究鉬與人體健康中，結(jié)果表明鉬是一種生命必需的微量元素。而對小鼠的研究，主要是心臟等方面， 20xx年，張才，朱重偉 ，等 [5]，發(fā)現(xiàn)鉬制劑不僅對接觸鉬制劑的小鼠本身有損害作用，還對小鼠的 2 后代產(chǎn)生損傷作用。銅參與動物的營養(yǎng)調(diào)節(jié)，還與動物的免疫功能有著密切的關(guān)系。比較兩種小鼠對急性和遲發(fā)性過敏應(yīng)答 的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)缺銅不影響小鼠對急性過敏的應(yīng)答，卻能明顯延遲小鼠對臭氧的遲發(fā)接觸過敏的應(yīng)答。而血銅升高主要與中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞被激活時分泌的一種白細(xì)胞內(nèi)源性物質(zhì)有關(guān)，該物質(zhì)隨血液到達(dá)相關(guān)靶細(xì)胞 ，并發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)及殺菌功能。它的變化較為客觀地顯示了機(jī)體免疫力的變化，老化的免疫細(xì)胞可以導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降，從而誘發(fā)一系 列的像傳染性、自身免疫系統(tǒng)紊亂和癌癥等疾病 [10]。 脾臟 脾是體內(nèi)最大的淋巴器官，其結(jié)構(gòu)與淋巴結(jié)有許多相似之處，也由淋巴組織構(gòu)成。脾的被膜和小梁內(nèi)含有數(shù)量不等的平滑肌纖維，小梁內(nèi)有發(fā)達(dá)的小梁動脈與靜脈。 (3) 動脈周圍淋巴鞘 是圍繞中央動脈周圍的厚層彌散淋巴組織，由 大量的 T 細(xì)胞、少量的巨噬細(xì)胞和交錯突細(xì)胞等構(gòu)成，屬胸腺依賴區(qū)，相當(dāng)于淋巴結(jié)的深層皮質(zhì)，但無高內(nèi)皮的毛細(xì)血管后微靜脈。 (5) 邊緣區(qū) 位于白髓與紅髓 之間，寬 100~500μm，呈紅色。 (6) 紅髓 占脾實(shí)質(zhì)的大部分，分布于被膜下，小梁周圍，白髓及邊緣區(qū)的外側(cè)。根據(jù)細(xì)胞成分的不同及毛細(xì)管的有無，可將脾索分為濾過區(qū)和非濾過區(qū)兩種不同功能的區(qū)域。當(dāng)血液從濾過區(qū)的血管滲出時，巨噬細(xì)胞即可清除衰老的紅細(xì)胞、抗原抗體復(fù)合物或其他異物。 (1) 免疫應(yīng)答 脾內(nèi)含有大量的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，侵入血內(nèi)的病原體，如細(xì)菌等，可引起脾內(nèi)發(fā)生免疫應(yīng)答，脾的體積和結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化。當(dāng)脾腫大或功能亢進(jìn)時，紅細(xì)胞破壞過多，可引起貧血；而切除脾后，學(xué)內(nèi)異形的衰老紅細(xì)胞會大量增加。不過，此時脾內(nèi)仍有少量的造血干細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體嚴(yán)重缺血或某些病理狀態(tài)下，脾可恢復(fù)造血功能。 5H2O），天津市化學(xué)試劑四廠； 多聚甲醛（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心； 蘇木素，上?？笊锛夹g(shù)有限公司； 甲明礬（硫酸鋁鉀），北京化工廠； 伊紅，上海楷洋生物技術(shù)有限公司； 乙醇（分析純），洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司； 二甲苯（分析純），天津市石英鐘廠霸州市化工分廠； 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，上海榮奕生物技術(shù)有限公司； 酶標(biāo)試劑，上海榮奕生物技術(shù)有 限公司； 5 樣品稀釋液，上海榮奕生物技術(shù)有限公司； 顯色劑 A 液，上海榮奕生物技術(shù)有限公司； 顯色劑 B 液，上海榮奕生物技術(shù)有限公司； 終止液，上海榮奕生物技術(shù)有限公司； 濃縮洗滌液，上海榮奕生物技術(shù)有限公司； 小鼠免疫球蛋白 IgG酶聯(lián)免疫分析試劑盒 試劑盒組成：說明書、封板膜、密封袋、酶標(biāo)包被板、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、酶標(biāo)試劑、樣品稀釋液、顯色劑 A液、顯色劑 B液、終止液、濃縮洗滌液 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用 ，兩組間差異采用ｔ檢驗(yàn)；多組間差異采用Ｓ－Ｎ－Ｋ的方 差分析，分析前各組及組間進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn) [12]。 （ 3）分化液（ 1 %鹽酸酒精溶液） 鹽酸 1 mL； 70 %酒精 99 mL 試驗(yàn)動物 75 只 21 日齡健康雄性昆明種小鼠，購自于鄭大動物實(shí)驗(yàn)中心。 表 1 小鼠飲用水中鉬銅含量表 （ mg/L） Table1 The different doses of molybdenum into drinking water I 組 II 組 III 組 IV組 Ⅴ 組 鉬含量 （ mg/L) 0 0 200 400 800 銅含量 （ mg/L） 0 50 50 50 50 動物組織病理切片的制作 取材與修塊 本實(shí)驗(yàn)用眼球放血法處死小鼠后，無菌條件下，立即采集小鼠的血液、脾臟。固定液用量一般為組織塊體積的 10~20倍。 脫水 脫水的方法是在室溫下將脫水劑用水配成不同的梯度濃度，然后將組織塊置入其逐級進(jìn)行脫水。 浸蠟 組織塊經(jīng)透明之后，在恒溫設(shè)備中進(jìn)行浸蠟本實(shí)驗(yàn)選用的是熔點(diǎn)為 54~56 ℃的石蠟，并將恒溫箱調(diào)至 58 ℃，選用二甲苯：石蠟（ 1:1）的混合液進(jìn)行預(yù)處理約 30 min， 58 ℃，然后浸入純石蠟（Ⅰ） 2~ 3h，純石蠟（Ⅱ） 2~3 h。夾角，厚度為 5 μ m，調(diào)節(jié)好刀口與組織塊的距離便可開始切片。 HE 染色 染色的目的在于使細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核不同成分之間有明顯的對比色，以利于顯微鏡下觀察。 1 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品空 10 空，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100μ l，在第一、第二孔中分別加標(biāo) 準(zhǔn)品稀釋液 50μ l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100 分μ l 別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μ l，混勻；然后在第三和第四孔中各取 50μ l 棄掉，再各取50μ l分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μ l，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50μ l分別加到第七、八孔中，再在第七、八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μ l，混勻后從第七、八孔中分別取 50μ l 加到第九、第十孔中，再在第九、十孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μ l，混勻后從第九、第十孔中各取 50μ l棄掉。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。 6加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μ l，空白孔除外， 7溫育：操作同 3。 11 測定：以空白空調(diào)零， 450nm 波長依序測量各孔的吸光度（ OD 值）。 III組、 IV組、 V組小鼠脾臟組織 H E染色可見被膜增厚、白髓減少或消失，動脈周圍鞘組織增厚 .肉芽腫是以淋巴細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤，部分中央壞死形成膿腫，外圍可見上皮樣細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞；膿腫壁由炎性肉芽組織包裹，其中有多核巨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等。 圖 1. 對照組（ 1010） 圖 0銅 50組（ 1010） the （ 1010） mu0cu50 group（ 1010） 10 圖 200銅 50組（ 1010） 圖 400銅 50組（ 1010） mu200cu50 group（ 1010） mu400cu50 group（ 1010） 圖 800銅 50組（ 1010） 圖 800銅 50組（ 1040） mu800cu50 group（ 1010） mu800cu50 group（ 1040） 小鼠的臨床表現(xiàn) 分別測量 ?周、 ?周、 ?周的脾臟的重量。 177。 III 177。 177。 177。 9 周與 5周和 7 周相比差異不顯著 (P＞ )。 7周 I與Ⅴ差異極顯著 (P＜ )， II 與Ⅴ差 異極顯著 (P＜ )， III 與 IV、Ⅴ差異極顯著 (P＜ )，這說明隨著鉬量的增加對小鼠的脾臟影響極大。 177。 III 177。 177。 177。 I 與 IV、Ⅴ相比差異極顯著 (P＜ )。 鉬銅聯(lián)合對小鼠免疫學(xué)指標(biāo)的影響 使用 小鼠免疫球蛋白酶聯(lián)免疫分析試劑盒，應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中小鼠免疫球蛋白 G(IgG)水平，用純化的小鼠 IgG 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 免疫球蛋白 G(IgG），再與 HRP 標(biāo)記的 IgG 抗體結(jié)合，形成抗體 抗原 酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。 12 表 4 小鼠血清中 IgG含量 （ ug/mL） Serum IgG levels in each group 組別 5 周 7 周 9 周 I 177。 177。 177。 V 177。 隨著小鼠的飼喂天數(shù)的增加，組間比較，小鼠血清中 IgG 含量呈下降趨 5 周與7 周相比差異顯著 (P＜ )， 5 周與 9 周相比差異極顯著 (P＜ )。 注：橫軸代表 5組小鼠，縱軸為小鼠血清中的 IgG 的含量 。但過量 的鉬可導(dǎo)致動物中毒，是由于高濃度鉬拮抗銅的吸收，而引發(fā)動物機(jī)體的繼發(fā)性銅缺乏，銅可參與造血和骨髓蛋白的合成，促進(jìn)畜禽增長并可提高免疫力 [14]。小梁之間充有網(wǎng)狀組織，夠長脾的海綿狀多孔隙細(xì)的細(xì)微支架 [15]。脾小體，即淋巴小結(jié)，位于動脈周圍淋巴鞘的一側(cè)，主要由 B細(xì)胞構(gòu)成，發(fā)育良好者也可呈現(xiàn)明區(qū)、暗區(qū)和小結(jié)帽 ，帽朝向紅髓。試驗(yàn)表明：不同劑量的鉬 (0mg／ L)、（ 200mg／ L)、（ 400mg／ L)、（ 800mg／ L)和一定劑量的銅聯(lián)合，可使動物脾臟發(fā)生充血、萎縮、脾內(nèi)淋巴細(xì)胞減少、實(shí)質(zhì)細(xì)胞萎縮等病理現(xiàn)象，并使其重量、生長指數(shù)急劇下降，與對照組產(chǎn)生極顯著的差異 (P0． 01)，使動物脾臟發(fā)生病理變化，生長發(fā)育受到抑制；而微量鉬可使脾小體含量增多，促進(jìn)免疫器官迅速增重，分析可能是微量鉬刺激脾臟的生長發(fā)育或鉬使機(jī)體免疫器官產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，功能亢進(jìn)，重量增加 [18]。 IgG主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成，是機(jī)體抗感染免疫的主力抗體。 IgG是血清中一種主要的免疫球蛋白，其含量反映機(jī)體的免疫狀況，起著抗體的作用，主要在仔豬腸道中發(fā)揮功效 [22]。長而增加 ， 但 10歲以前未達(dá)到成人水平因此與文獻(xiàn)報道的 3～ 5歲接近成人水平的結(jié)論不同 [24]。 5周時各組之間的差異比較顯著，隨著鉬含量的增加，小鼠血清中 IgG含量隨之增長，到 7周時不同鉬銅含量的小鼠血清中 IgG 含量差異不大，但較之前數(shù)值有所降低，這說明隨著小鼠飼喂天數(shù)的增加小鼠血清中的 IgG 下降幅度較大，小鼠的免疫功能有下所降。 15 參考文獻(xiàn) [1] 王宏偉 , 周變?nèi)A , 張樑 , 等 . 高鉬低銅對小鼠腎臟結(jié)構(gòu)及其表達(dá) TNFa 蛋白的影響 [J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 , 20xx,31(9):5154. [2] 楊自軍 . 豫西地區(qū)鉬的生態(tài)分布與綿羊鉬中毒防治研究 [D]. 南京 : 南京農(nóng) 業(yè)大學(xué) 。 感謝 臨床試驗(yàn) 室所有老師在 我實(shí)驗(yàn) 和論文完成過程中給予的指導(dǎo)和幫助 。我將在以后的工作 生活中 繼續(xù)以科大的校訓(xùn)為標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格要求自己，讓明日科大以我為自豪 。 我們的研究結(jié)果表明，熱休克同源蛋白 70（ HSC70）水平從 A 魯本斯，這期間 S?rfjord（北海，挪威西南海岸）沿污染梯度收集體腔細(xì)胞實(shí)地研究中，直接與在皮層的鎘，銅的長期積累的重金屬是完全相關(guān)。簡而言之，我們的研究結(jié)果證實(shí)，棘皮動物的免疫細(xì)胞是一個合適 的指標(biāo)作為長期暴露于污染環(huán)境的評估，而且該水平的提高在HSC70 蛋白質(zhì)狀態(tài)在可以允許的的大范圍內(nèi)被認(rèn)為是可以接受的信號響應(yīng)對于金屬污染發(fā)生的變化。該 S248。即使現(xiàn)在，盡管進(jìn)行廢物處理，該S248。托雷斯等人， 20xx）?；顫姷?， 20xx。同樣，在實(shí)驗(yàn)室研究中，我們證實(shí)在截肢或傷海星魯本斯（海星）發(fā)生循環(huán)體腔細(xì)胞的更新速度快的具有增加的 HSC70 表達(dá) 有關(guān) （ Pinsino 等， 20xx。它 早已被 描述如下： S248。我們發(fā) 現(xiàn) 這 種 HSC70 水平與長期積累 在體壁銅 、鎘 重金屬 嚴(yán)格相關(guān) ， 它 反映了沿著峽灣站的工業(yè)污染梯度。 Dubois等人， 20xx）。對于每個采樣點(diǎn)重金屬含量（銅 ， 鎘，鉛，鋅） 確定 是在 teguments 和 10幽門盲囊海星 距 每個采樣點(diǎn)約 5E7厘米，通過測量臂末端的嘴。該 細(xì)胞懸浮 后立即在室溫下以1500r/min 離心 10