【正文】 討，主要集中在原輔料的選擇和發(fā)酵工藝兩個方面，但是要想從根本上提高黃酒的品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，最為關(guān)鍵的是選育低產(chǎn)高級醇的優(yōu)良釀酒酵母菌株。在支鏈氨基酸分解生成高級醇的代謝途徑中，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的缺失可阻斷或者減弱支鏈氨基酸轉(zhuǎn)變成α酮酸的生成量，進而減少亮氨酸生成異戊醇及纈氨酸生成異丁醇的產(chǎn)量。Rous[55]等人通過紫外誘變的方法選育出一株異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株，用該突變株進行葡萄酒發(fā)酵時生成的異戊醇的含量比出發(fā)菌株降低了50%，同時總高級醇的生成量降低了20%。根據(jù)生成高級醇的兩條代謝途徑，選育高級醇代謝過程中某些關(guān)鍵性酶活性降低或失活的菌株，從而可以阻斷或減弱生成高級醇的代謝途徑，以達到顯著降低黃酒中高級醇含量的目的[47]。 酵母菌的接種量及增殖倍數(shù)黃酒發(fā)酵醪液中，酵母細胞的數(shù)量與發(fā)酵力的大小相對應(yīng)，酵母細胞接種后經(jīng)過生長繁殖，其數(shù)量會達到一定的范圍內(nèi)，以滿足發(fā)酵力的需要。Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高級醇[38]，即合成代謝途徑：糖類提供合成氨基酸的碳骨架，然后在合成代謝的最后階段形成α酮酸中間體，α酮酸中間體經(jīng)脫羧和還原形成相應(yīng)的高級醇[39]。中低沸點酯類的含量是隨著發(fā)酵過程的進行而不斷增加的，而高級酯類則增加的非常少，高級酯大部分產(chǎn)生于黃酒陳釀過程中，其含量隨著貯存時間而逐漸升高[7,20]。黃酒這種獨特的風味特征，是眾多風味物質(zhì)綜合反應(yīng)的集中體現(xiàn)。黃酒中富含的營養(yǎng)物質(zhì)有氨基酸、糖、肽等，其中黃酒中的氨基酸不僅種類高達20種之多，而且其含量非常豐富，其中人體必需的8種氨基酸含量，居釀造酒之首。2006年至2010年， 萬千升，合計增長110%，年平均復合增長率為20%。適宜的高級醇含量能給人以柔和、醇厚、圓潤、豐滿及協(xié)調(diào)的感覺。在正常發(fā)酵液中生成的高級醇總量，75%是由糖代謝產(chǎn)生的，另外25%來源于Ehrlich途徑[2627]。 在整個黃酒釀造過程中，氨基酸的含量是一個動態(tài)過程，其原因主要為以下兩個方面：一是酵母菌等微生物的生長繁殖需要消耗氨基酸，二是在蛋白酶的作用下蛋白質(zhì)可以不斷水解為氨基酸。但是酵母菌在有氧條件和無氧條件下的生理代謝活動是不同的，酵母菌在高含氧量條件下比在低含氧量條件下的生長代謝旺盛。（1）黃酒中高級醇分子的直徑一般比酒中其他主要成分分子的直徑大，根據(jù)這一特點，可以利用濾膜裝置來截留分子直徑較大的高級醇分子[52]。 細胞融合育種細胞融合又稱為原生質(zhì)體融合，該技術(shù)也常用于選育酵母菌種。醇脫氫酶是高級醇形成途徑中催化醛類還原形成高級醇的重要酶，Atsumi[70]等人指出ADH2基因編碼的醇脫氫酶是催化異丁醛和異戊醛形成異丁醇和異戊醇的關(guān)鍵性酶，通過過量表達ADH2基因，顯著提高了異丁醇和異戊醇的生成量。（2）BATBAT2基因雙敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。 主要溶液（1）葡萄糖標準溶液準確稱取經(jīng)過105℃ g，然后用蒸餾水溶解，再加入5 mL的濃鹽酸，最終用蒸餾水定容至1 L。同時為了防止酒精揮發(fā)，在蒸餾過程中應(yīng)使量筒始終處于冰浴中。先進樣需要檢測的標準品溶液，可測得各物質(zhì)的保留時間。在HA1片段的上游設(shè)計引物HS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計引物KS2用于HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株的上游驗證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計引物KX2和在HB1片段的下游設(shè)計引物HX用于HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株的下游驗證。mol/L) 1 μL下游引物(10 181。 （5）13000 rpm空甩2 min后，棄掉收集管。6）挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，然后進行酶切和電泳驗證。10）為了增加質(zhì)粒的回收率，可以將上步離心得到的洗脫液重新滴加到吸附柱中，并在室溫下放置5 min，12000 rpm離心1 min。7）離心去除上清液，用200～500 μL無菌水重新懸浮菌體，然后取適量菌液涂布G418抗性YEPD平板，培養(yǎng)2~3 d后挑取能夠正常生長的轉(zhuǎn)化子。將重組質(zhì)粒pUCBA經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，獲得2686 bp和277 bp大小的特異性條帶；將重組質(zhì)粒pUCBAB經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，獲得2963 bp和317 bp大小的特異性條帶；將重組質(zhì)粒pUCBABK經(jīng)BamHI單酶切，獲得3280 bp和1613 bp大小的特異性條帶，這些片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致，基本證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，然后將質(zhì)粒送往測序公司進行基因測序，結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，其中KanMX與BA和BB連接方向相反。 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量的比較BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株黃酒發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液的蒸餾液進行氣相色譜分析，檢測突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)高級醇的含量，結(jié)果見表32。 重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程如圖33，將純化的BA片段用EcoRI和BamHI進行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUC19質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBA。2）對于每一個轉(zhuǎn)化，都要小心按下列順序加入“轉(zhuǎn)化混合液”：PEG3350（50% m/v） 240 μL mol/L乙酸鋰 36 μLssDNA（ mg/mL） 50 μL轉(zhuǎn)化片段（～10 μg） 34 μL3）劇烈振蕩直到完全混勻。6）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液之后，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進收集管中。（2）轉(zhuǎn)化1）從70℃冰箱中取出感受態(tài)細胞，并置于冰浴融化。（1） mL EP管中，每管含量應(yīng)小于15 μg。（11） mL EP管中，然后向吸附膜中央懸空滴加50~200 μL預(yù)先經(jīng)過65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5 min，12000 rpm離心2 min。（2）HOM2基因一個等位基因敲除的突變株RY11的構(gòu)建及驗證所需引物根據(jù)GenBank報道的HOM2基因序列設(shè)計一對引物HOM2U和HOM2D，用于驗證黃酒酵母基因組中HOM2基因的存在。載氣條件：載氣為高純氮，并將其流速設(shè)置為2 mL/min。（13）%內(nèi)標液 mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 %（V/V）的內(nèi)標液，4℃冷藏。（4）麥汁培養(yǎng)基稱取一定量粉碎的麥芽，按1：5的料水比于65℃水浴鍋中糖化34 h至碘檢完畢，然后經(jīng)過過濾、煮沸、過濾，并用糖度計調(diào)整外觀糖度至13176。以上結(jié)果顯示，BAT2基因敲除對異丁醇的生成量有顯著影響，對黃酒中含量最高的異戊醇的生成量影響不太顯著，而對正丙醇則沒有影響，本課題將繼續(xù)研究高級醇代謝途徑中的相關(guān)基因?qū)Ω呒壌忌闪康挠绊?。Lilly[64]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變菌株發(fā)酵生成異丁醇的含量顯著下降。Ingraham[34]等人選育出了亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株，該突變株發(fā)酵產(chǎn)異戊醇的含量降低了95%，但由于該突變株需要在富含亮氨酸的培養(yǎng)基中生長，而且其發(fā)酵性能也明顯降低，所以限制了該菌在工業(yè)上的應(yīng)用。選擇適宜的制曲工藝，經(jīng)選育得到優(yōu)良的曲霉菌種，以控制其產(chǎn)酶數(shù)量。一般情況下，如果改變發(fā)酵溫度，那么黃酒中高級醇的種類及數(shù)量也會發(fā)生改變，從而影響到各種高級醇之間的平衡[48]。圖13 Harris途徑 Harris pathway 影響黃酒中高級醇含量的主要因素影響黃酒中高級醇含量的因素有很多，如原輔料的成分及比例、發(fā)酵工藝的控制、酵母菌種及黃酒后處理工藝等，這些因素相互作用，共同決定黃酒中的高級醇含量[43]。黃酒中一些不愉快的味感部分來自于脂肪酸，所以黃酒中脂肪酸的含量以少一點為好。 高級醇對黃酒風味的影響高級醇通常又被稱為雜醇油，是指具有三個碳原子以上的一元醇類物質(zhì)的總稱。黃酒是傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健佳品，目前的初步研究已經(jīng)表明，黃酒具有抗衰老、抗氧化、降膽固醇、降血壓、參與機體的代謝活動和免疫調(diào)節(jié)等功效[56]。黃酒是一種集飲用與保健為一體的釀造酒，是我國重點發(fā)展和扶植的飲料酒之一。黃酒中的高級醇主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、β苯乙醇等[1112]，其中含量最高的是異戊醇和異丁醇，其次是正丙醇和苯乙醇[13]。黃酒中的氨基酸含量豐富，賦予黃酒復雜的口感。 黃酒釀造原輔料黃酒發(fā)酵過程中，原料及微生物中蛋白質(zhì)的分解是氨基酸的主要來源。若發(fā)酵溫度過高，那么酵母菌對氨基酸的脫氨基作用就會加速，同時還會加速酵母菌自溶產(chǎn)生大量氨基酸，由于發(fā)酵溫度過高造成的這兩種反應(yīng)都會增加高級醇的生成量。嚴格控制黃酒發(fā)酵溫度，使其不能超過工藝要求，并降低發(fā)酵末期的溫度。誘變育種的方法雖然簡單易操作，但其缺點也是顯而易見的。Nissim[65]等人構(gòu)建的BAT1和BAT2基因敲除的突變株，其異丁醇的生成量顯著降低，但是沒有報導該突變株異戊醇的生成量及其發(fā)酵性能的變化情況。本課題的目的是在探討釀酒酵母高級醇代謝機理的基礎(chǔ)上，研究BATHOM2基因敲除以及BAT1和BAT2基因雙敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響，為理論研究提供指導。Brix，115℃、 min。 分析方法 CO2失重的測定黃酒發(fā)酵時，用帶有針孔的橡皮塞塞緊瓶口，置于30℃條件下靜置發(fā)酵，在黃酒發(fā)酵過程中每隔12 h稱重一次，稱重前充分晃動三角瓶中的發(fā)酵液以盡可能趕走瓶中CO2, 當發(fā)酵失重小于1 g/12 h時，表明黃酒發(fā)酵已經(jīng)基本結(jié)束。升溫程序：起始柱溫設(shè)置為50℃，并以5℃ /min的升溫速度上升至80℃，然后再以10℃/min升溫升至150℃。在HOM2基因外部的上下游分別設(shè)計一對引物HAU和HAD及HBU和HBD，分別擴增HOM2基因兩側(cè)非編碼區(qū)的片段HA和HB，用于同源重組敲除HOM2基因。（12）將上述離心所得洗脫液再重新加入到吸附柱中，室溫靜置5 min，12000 rpm離心2 min，即得到高質(zhì)量的基因組DNA。 （2）然后向EP管中加入4～5倍體積的Buffer CP，用移液槍充分吹吸混勻后，再將其轉(zhuǎn)移到藍色的回收柱中。2）加入連接產(chǎn)物10 μL，輕輕混勻，冰浴30 min。7）再向吸附柱中加入500 μL的漂洗液，然后12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進收集管中。4）30℃恒溫箱中保溫30 min。將純化后的BB片段用BamHI和PstI 進行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUCBA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBAB。表32 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量比較Table 32 Higher alcohols production of BAT1 mutant strains and parent strains菌株正丙醇（mg/L）異丁醇（mg/L）異戊醇（mg/L）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，出發(fā)菌株RY1a1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/ mg/L，突變株RY1a1?bat1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/。 圖32 BA、BB和KanMX基因片段的PCR產(chǎn)物 PCR product of BA, BB and KanMX fragmentM：DL5000 DNA Marker；1：BA；2：BB；3：KanMX圖33 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程圖 Construction of rebinant plasmid pUCBABK 重組質(zhì)粒的驗證根據(jù)重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程，分別將重組質(zhì)粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK進行酶切驗證，電泳結(jié)果如圖34。6）13000 rpm離心30 s，去除上層轉(zhuǎn)化液，然后加入1 ml YEPD重新懸浮菌體，30℃100 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。9） 將吸附柱置于新的離心管中，并向吸附膜中央懸空滴加50～200 μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，于室溫下放置5 min，然后12000 rpm離心1 min。4）加入適量的經(jīng)37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)1 h，5）取適量菌液涂布含Amp+抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜。 （4）向離心管中加入700 μL DNA Wash Buffer，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，此操作重復兩次。表25 PCR反應(yīng)體系Table 25 PCR reaction system成分加樣量10LA Taq Buffer 2 μLdNTPs ( mmol/L) μL上游引物(10 181。（3）HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株RY13的構(gòu)建及驗證所需引物在HOM2基因保守區(qū)的兩端分別設(shè)計一對引物HA1U和HA1D及HB1U和HB1D，分別擴增HOM2基因的部分片段（分別命名為HA1片段和HB1片段），用于同源重組中斷HOM2基因。（3）分析方法保留時間法為氣相色譜定性鑒定中最常用的分析方法，在一定的色譜條件下，各物質(zhì)的出峰時間保持不變。用100 mL的量筒量取100 mL發(fā)酵液于1000 mL的蒸餾瓶中，然后加入100 mL蒸餾水，再加入適量的消泡劑，搖勻，接入蒸餾裝置，并用100 mL量筒作為接收器收集蒸餾液。以上前四種培養(yǎng)基的固體培養(yǎng)基需再加2%的瓊脂。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段BAKanMXBB導入黃酒酵母單倍體出發(fā)菌株中，篩選得到BAT1基因敲除突變株，并將BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株進行黃酒發(fā)酵實驗，研究BAT1基因敲除對黃酒酵母單倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。Dickenson[6769]等人研究發(fā)現(xiàn)，由YDL080C基因編碼的類丙酮酸脫羧酶是α酮基異己酸分解形成異戊醇的關(guān)鍵酶，構(gòu)建YDL080C基因缺失的突變株，能夠阻斷或者減弱α酮基異己酸轉(zhuǎn)化形成異戊醇的途徑，從而降低異戊醇的生成量。其次，進行誘