【正文】 源于Ehrlich途徑[2627]。黃酒中一些不愉快的味感部分來自于脂肪酸，所以黃酒中脂肪酸的含量以少一點(diǎn)為好。黃酒中的酯類物質(zhì)種類豐富，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸異戊酯等，其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯，占酯類物質(zhì)總量的85%以上[19]。黃酒中高級(jí)醇含量僅次于異戊醇的是異丁醇，異丁醇的毒性雖然比異戊醇的毒性小，但是異丁醇含量過多也會(huì)刺激人的眼、鼻。適宜的高級(jí)醇含量能給人以柔和、醇厚、圓潤、豐滿及協(xié)調(diào)的感覺。 高級(jí)醇對(duì)黃酒風(fēng)味的影響高級(jí)醇通常又被稱為雜醇油，是指具有三個(gè)碳原子以上的一元醇類物質(zhì)的總稱。 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述黃酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝賦予了其豐滿、醇和、柔順、圓潤、濃郁、悠長的感覺，也賦予了其醇、香、柔、爽的獨(dú)特風(fēng)味[7]。但是，目前仍存在著一些問題制約著黃酒行業(yè)的快速發(fā)展，如消費(fèi)市場地域性限制沒有突破導(dǎo)致市場拓展艱難、業(yè)內(nèi)存在著無序競爭從而導(dǎo)致黃酒價(jià)值低估身價(jià)降低、傳統(tǒng)觀念影響從而導(dǎo)致創(chuàng)新能力不夠以及過分強(qiáng)調(diào)傳統(tǒng)的黃酒釀造技術(shù)從而導(dǎo)致黃酒生產(chǎn)效率難以提高等。2006年至2010年， 萬千升，合計(jì)增長110%，年平均復(fù)合增長率為20%。黃酒是傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健佳品，目前的初步研究已經(jīng)表明，黃酒具有抗衰老、抗氧化、降膽固醇、降血壓、參與機(jī)體的代謝活動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)等功效[56]。黃酒是一種高營養(yǎng)性的飲料酒，所以又被譽(yù)為“液體蛋糕”。天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響畢業(yè)論文目 錄1 前 言 1 黃酒概述 1 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述 1 高級(jí)醇對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 2 酯類對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 3 其他類物質(zhì)對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 3 黃酒發(fā)酵過程中高級(jí)醇的形成與控制 3 高級(jí)醇的形成機(jī)理 3 影響黃酒中高級(jí)醇含量的主要因素 6 降低黃酒中高級(jí)醇含量的主要措施 7 低產(chǎn)高級(jí)醇酵母菌株的研究進(jìn)展 8 誘變育種 8 細(xì)胞融合育種 9 基因工程育種 9 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容 10 10 本課題的主要研究內(nèi)容 112 材料與方法 13 材料與儀器 13 主要試劑 13 主要實(shí)驗(yàn)儀器 14 菌種與質(zhì)粒 15 主要培養(yǎng)基 15 主要溶液 16 分析方法 17 CO2失重的測定 17 酒精度的測定 17 還原糖的測定 17 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測定 18 生長曲線的測定 18 實(shí)驗(yàn)方法 19 引物設(shè)計(jì) 19 各目的基因片段的獲得 21 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 23 酵母轉(zhuǎn)化 25 G418抗性基因的去除 26 黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 263 結(jié)果與討論 28 BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 28 BAT1基因的驗(yàn)證 28 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 28 BAT1基因敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 30 BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 32 小結(jié)與討論 33 BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 33 BATBAT2基因雙敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 33 突變株與出發(fā)菌株生長性能的比較 34 BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 35 小結(jié)與討論 36 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 37 HOM2基因的驗(yàn)證 37 重組質(zhì)粒pUCHABK的構(gòu)建 38 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株的獲得及驗(yàn)證 40 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 41 遺傳標(biāo)記基因KanMX的去除 42 小結(jié)與討論 44 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 44 重組質(zhì)粒pUCHB1A1K的構(gòu)建 44 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株的獲得及驗(yàn)證 47 突變株與出發(fā)菌株生長性能的比較 48 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 49 小結(jié)與討論 504 結(jié) 論 515 展 望 526 參考文獻(xiàn) 537 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況 588 致 謝 591 前 言 黃酒概述黃酒是我國的民族特產(chǎn)，至今已經(jīng)有7千年的歷史，與啤酒、葡萄酒并稱為世界上三大最古老的釀造酒[1]。黃酒中富含的營養(yǎng)物質(zhì)有氨基酸、糖、肽等，其中黃酒中的氨基酸不僅種類高達(dá)20種之多，而且其含量非常豐富，其中人體必需的8種氨基酸含量，居釀造酒之首。黃酒是一種集飲用與保健為一體的釀造酒，是我國重點(diǎn)發(fā)展和扶植的飲料酒之一。黃酒行業(yè)龍頭骨干不斷做大做強(qiáng)，發(fā)展迅速。隨著人們生活水平和物質(zhì)文化的日益提高，消費(fèi)者對(duì)黃酒產(chǎn)品的品質(zhì)要求也在不斷的提高和變化，包括黃酒的風(fēng)味口感和營養(yǎng)價(jià)值等，特別是消費(fèi)者隨著對(duì)黃酒的認(rèn)識(shí)越來越高，對(duì)形成其風(fēng)味的微量成分也越來越重視。黃酒這種獨(dú)特的風(fēng)味特征，是眾多風(fēng)味物質(zhì)綜合反應(yīng)的集中體現(xiàn)。黃酒中的高級(jí)醇主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、β苯乙醇等[1112]，其中含量最高的是異戊醇和異丁醇，其次是正丙醇和苯乙醇[13]。所以黃酒中的高級(jí)醇含量不宜過低或過高：若過低，酒味淡，酒體不豐滿；若過高，不但造成酒體有不愉快的異雜味，還會(huì)有較強(qiáng)的致醉性，也就是人們俗稱的“上頭”[1417]。對(duì)人體粘膜有刺激性作用的正丙醇對(duì)人體生理作用則和乙醇相近。中低沸點(diǎn)酯類的含量是隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行而不斷增加的，而高級(jí)酯類則增加的非常少，高級(jí)酯大部分產(chǎn)生于黃酒陳釀過程中，其含量隨著貯存時(shí)間而逐漸升高[7,20]。黃酒中的氨基酸含量豐富，賦予黃酒復(fù)雜的口感。圖11 高級(jí)醇合成途徑 Synthesis pathway of higher alcohols 分解代謝途徑（Ehrlich代謝機(jī)制）1907年，德國化學(xué)家Ehrlich[28]最早提出了由氨基酸的分解代謝形成高級(jí)醇的途徑。圖12 Ehrlich代謝途徑 Ehrlich pathway根據(jù)此反應(yīng)機(jī)制，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等都可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的高級(jí)醇。Thouki于1958年提出由葡萄糖能直接形成高級(jí)醇[38]，即合成代謝途徑：糖類提供合成氨基酸的碳骨架，然后在合成代謝的最后階段形成α酮酸中間體，α酮酸中間體經(jīng)脫羧和還原形成相應(yīng)的高級(jí)醇[39]。 黃酒釀造原輔料黃酒發(fā)酵過程中，原料及微生物中蛋白質(zhì)的分解是氨基酸的主要來源。由于發(fā)酵醪中存在過量的氨基酸時(shí)會(huì)通過分解代謝途徑轉(zhuǎn)化為高級(jí)醇，因此控制發(fā)酵醪中初始物的濃度可以有利于降低高級(jí)醇的生成量[38]。酵母菌在黃酒發(fā)酵過程中，能快速同化的氨基酸只有8種，但是酵母菌生長繁殖過程中需要的不僅僅是這8中氨基酸，所以酵母菌只能依靠自身合成那些不能被自身同化的氨基酸。 酵母菌的接種量及增殖倍數(shù)黃酒發(fā)酵醪液中，酵母細(xì)胞的數(shù)量與發(fā)酵力的大小相對(duì)應(yīng)，酵母細(xì)胞接種后經(jīng)過生長繁殖，其數(shù)量會(huì)達(dá)到一定的范圍內(nèi)，以滿足發(fā)酵力的需要。若發(fā)酵溫度過高，那么酵母菌對(duì)氨基酸的脫氨基作用就會(huì)加速，同時(shí)還會(huì)加速酵母菌自溶產(chǎn)生大量氨基酸，由于發(fā)酵溫度過高造成的這兩種反應(yīng)都會(huì)增加高級(jí)醇的生成量。酵母菌在溶氧高的發(fā)酵條件下形成的高級(jí)醇含量明顯增加，這一點(diǎn)在葡萄酒和啤酒的釀造工藝中都有所證實(shí)[49]。武慶尉等[51]研究發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶的添加量也能改變高級(jí)醇的生成量，適當(dāng)?shù)卦黾铀嵝缘鞍酌傅氖褂昧繒r(shí)，%，但是酸性蛋白酶的添加量過多時(shí)又會(huì)使高級(jí)醇的含量增加。根據(jù)生成高級(jí)醇的兩條代謝途徑，選育高級(jí)醇代謝過程中某些關(guān)鍵性酶活性降低或失活的菌株，從而可以阻斷或減弱生成高級(jí)醇的代謝途徑，以達(dá)到顯著降低黃酒中高級(jí)醇含量的目的[47]。嚴(yán)格控制黃酒發(fā)酵溫度，使其不能超過工藝要求，并降低發(fā)酵末期的溫度。同時(shí)也可以利用大孔型吸附樹脂達(dá)到定向吸附酒中高級(jí)醇分子的目的[53]，從而降低黃酒中的高級(jí)醇含量。 誘變育種誘變育種是一種有效而且容易操作的育種方法，常用于選育低產(chǎn)高級(jí)醇酵母菌株。Rous[55]等人通過紫外誘變的方法選育出一株異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株，用該突變株進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵時(shí)生成的異戊醇的含量比出發(fā)菌株降低了50%，同時(shí)總高級(jí)醇的生成量降低了20%。誘變育種的方法雖然簡單易操作，但其缺點(diǎn)也是顯而易見的。Nobuhiko[58]等人將賴氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株K14和呼吸缺陷型菌株NCYC1333進(jìn)行細(xì)胞融合，從而得到了耐酒精力高、絮凝性較低、高級(jí)醇生成量適中的優(yōu)良菌株F32。與傳統(tǒng)育種方法相比，基因工程育種具有針對(duì)性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定、周期性短等優(yōu)點(diǎn)，并克服了遠(yuǎn)源雜交不親和性，所以說基因工程育種是一種非常優(yōu)越的育種方法。在支鏈氨基酸分解生成高級(jí)醇的代謝途徑中，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的缺失可阻斷或者減弱支鏈氨基酸轉(zhuǎn)變成α酮酸的生成量，進(jìn)而減少亮氨酸生成異戊醇及纈氨酸生成異丁醇的產(chǎn)量。Nissim[65]等人構(gòu)建的BAT1和BAT2基因敲除的突變株，其異丁醇的生成量顯著降低，但是沒有報(bào)導(dǎo)該突變株異戊醇的生成量及其發(fā)酵性能的變化情況。 天冬氨酸β半醛脫氫酶對(duì)高級(jí)醇生成量的影響Styger[71]等人研究指出，HOM2基因編碼的天冬氨酸β半醛脫氫酶對(duì)高級(jí)醇的生成有重要影響，構(gòu)建的HOM2基因缺失菌株生成異丁醇和異戊醇的含量有顯著性降低。高級(jí)醇是黃酒的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，適宜的高級(jí)醇含量及各種高級(jí)醇含量之間比例的協(xié)調(diào)可以使酒體豐滿圓潤，口感柔和協(xié)調(diào)；如果高級(jí)醇含量過高，不但會(huì)給酒體帶來不愉快的異雜味，影響黃酒的品質(zhì)，而且有較強(qiáng)的致醉性，危害人的身體健康。許多廠家和科研機(jī)構(gòu)對(duì)降低黃酒中高級(jí)醇含量進(jìn)行了大量研究和探討，主要集中在原輔料的選擇和發(fā)酵工藝兩個(gè)方面，但是要想從根本上提高黃酒的品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，最為關(guān)鍵的是選育低產(chǎn)高級(jí)醇的優(yōu)良釀酒酵母菌株。本課題的目的是在探討釀酒酵母高級(jí)醇代謝機(jī)理的基礎(chǔ)上，研究BATHOM2基因敲除以及BAT1和BAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響，為理論研究提供指導(dǎo)。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段BAKanMXBB導(dǎo)入本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的BAT2基因敲除黃酒酵母單倍體菌株中，篩選得到BATBAT2基因雙敲除突變株，并將BATBAT2基因雙敲除突變株及其單敲除突變株與出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母單倍體菌株的高級(jí)醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。（4）HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響。表22 實(shí)驗(yàn)儀器Table 22 Instruments and apparatuses used in this work儀器公司電熱恒溫水浴鍋天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司恒溫?fù)u床上海制成儀器制品有限公司生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司電子天平梅特勒托利多儀器有限公司高壓蒸汽滅菌鍋山東新華醫(yī)療器械廠 電熱鼓風(fēng)干燥箱DL102型 天津市實(shí)驗(yàn)器械廠HS1300V型超凈臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司臺(tái)式高速離心機(jī)上海醫(yī)用分析儀器廠GL20A型高速冷凍離心機(jī)中科院生物物理所技術(shù)服務(wù)公司722型光度分光光度計(jì)天津市普瑞斯儀器有限公司pHSJ4A型實(shí)驗(yàn)pH計(jì)上?？茖W(xué)儀器有限公司P型移液器法國吉爾森公司PCT200型PCR基因擴(kuò)增儀美國BIORAD公司DYY4c型電泳儀北京市六一儀器廠全自動(dòng)凝膠成像儀美國SYNGENE公司7890A 氣象色譜儀北京安捷倫科技有限公司 菌種與質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)中所使用的黃酒酵母菌株、大腸桿菌菌株和質(zhì)粒載體如表23所示：表23本實(shí)驗(yàn)所使用菌株和質(zhì)粒的性質(zhì)及來源Table 23 Strains and plasmids used in this study菌株或質(zhì)粒背景介紹來源菌株（Strains）RY1工業(yè)用黃酒酵母二倍體天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1a1MATa，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1α3MATα，工業(yè)用黃酒酵母單倍體菌株天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1a1?bat2MATa ?bat2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY1α3?bat2MATα ?bat2天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室RY11MATa/MATα ?hom2::kan本研究RY12MATa/MATα ?hom2本研究RY13MATa/MATα ?hom2/?hom2::kan本研究RY1a1?bat1MATa ?bat1::kan本研究RY1α3?bat1MATα ?bat1::kan本研究RY1a1?bat1?bat2MATa ?bat2?bat1::kan本研究RY1α3?bat1?bat2MATα ?bat2?bat1::kan本研究質(zhì)粒（Plasmids）pUC19Ampr，克隆載體天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pUG6攜帶KanMX抗性基因天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pGAPza攜帶Zeocin抗性基因天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室pUCBABKAmpr，敲除BAT1基因的重組質(zhì)粒本研究pUCHABKAmpr，敲除HOM2基因的重組質(zhì)粒本研究pUCHB1A1KAmpr，敲除HOM2基因的重組質(zhì)粒本研究 主要培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基（w/v）胰蛋白胨1%，氯化鈉1%，%，蒸餾水配制，pH ，115℃、 min。Brix，115℃、 min。（2）斐林甲液分別稱取15 g五水硫酸銅， g次甲基藍(lán)，用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。（6）酚氯仿溶液按照25：24：1的體積比分別量取Tris飽和酚、氯仿、異戊醇，然后混合均勻，存放于棕色瓶內(nèi)，并4℃保存。（10）60%乙醇溶液量取60 mL色譜純的無水乙醇，然后用去離子水定容至100 mL。 分析方法 CO2失重的測定黃酒發(fā)酵時(shí)，用帶有針孔