【正文】 個(gè)等位基因敲除的突變株RY13的構(gòu)建及驗(yàn)證所需引物在HOM2基因保守區(qū)的兩端分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物HA1U和HA1D及HB1U和HB1D，分別擴(kuò)增HOM2基因的部分片段（分別命名為HA1片段和HB1片段），用于同源重組中斷HOM2基因。（6）消化完全后加入200 μL溶液B，200 μL無(wú)水乙醇，并充分地顛倒混勻，這時(shí)可能有絮狀沉淀產(chǎn)生，并不影響DNA的提?。梢詫⑷芤号c絮狀沉淀都加入到吸附柱中，然后室溫放置2 min，最好能充分混勻以減少沉淀）。表25 PCR反應(yīng)體系Table 25 PCR reaction system成分加樣量10LA Taq Buffer 2 μLdNTPs ( mmol/L) μL上游引物(10 181。（4）向電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液并使其液面高出膠面1 mm左右。 （4）向離心管中加入700 μL DNA Wash Buffer，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，此操作重復(fù)兩次。5）然后向大腸桿菌菌體沉淀中加入20 mL冰浴的Solution A，輕輕晃動(dòng)以懸浮菌體沉淀，禁止劇烈振蕩。4）加入適量的經(jīng)37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)1 h，5）取適量菌液涂布含Amp+抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜。1） mL的EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清。9） 將吸附柱置于新的離心管中，并向吸附膜中央懸空滴加50～200 μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，于室溫下放置5 min，然后12000 rpm離心1 min。 酵母轉(zhuǎn)化酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[7879]的主要操作步驟如下：（1）酵母感受態(tài)的制備1）取斜面酵母菌種一環(huán)于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜。6）13000 rpm離心30 s，去除上層轉(zhuǎn)化液，然后加入1 ml YEPD重新懸浮菌體，30℃100 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。 黃酒發(fā)酵將30 ml二級(jí)種子液接種到加有100 g 大米（煮熟并攤涼）、10 g麥曲、45 mL米漿水和60 mL清水的500 mL直口三角瓶?jī)?nèi)，塞上插有針孔的橡膠塞，置于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d。 圖32 BA、BB和KanMX基因片段的PCR產(chǎn)物 PCR product of BA, BB and KanMX fragmentM：DL5000 DNA Marker；1：BA；2：BB；3：KanMX圖33 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程圖 Construction of rebinant plasmid pUCBABK 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證根據(jù)重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程，分別將重組質(zhì)粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK進(jìn)行酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖34。根據(jù)釀酒酵母基因組上重組位點(diǎn)兩端的基因序列和插入片段的序列，分別設(shè)計(jì)兩組上下游引物BS和KSBATKXBAT1和BX用以驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。表32 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級(jí)醇生成量比較Table 32 Higher alcohols production of BAT1 mutant strains and parent strains菌株正丙醇（mg/L）異丁醇（mg/L）異戊醇（mg/L）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，出發(fā)菌株RY1a1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/ mg/L，突變株RY1a1?bat1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/。若基因片段BAKanMXBB已整合到出發(fā)菌株的染色體中，則會(huì)在含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板上生長(zhǎng)。將純化后的BB片段用BamHI和PstI 進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUCBA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBAB。（2）一級(jí)種子培養(yǎng)：取活化的斜面菌種一環(huán)，接種于裝有5 mL麥汁培養(yǎng)基的試管中，30℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)12 h。4）30℃恒溫箱中保溫30 min。將去磷酸化后的產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物純化回收的步驟進(jìn)行回收，然后置于20℃保存。7）再向吸附柱中加入500 μL的漂洗液，然后12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進(jìn)收集管中。5）12000 rpm離心5 min以上，取其上清，進(jìn)行電泳驗(yàn)證。2）加入連接產(chǎn)物10 μL，輕輕混勻，冰浴30 min。3）將上述培養(yǎng)菌液按1%的比例轉(zhuǎn)接至裝有200 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃，220 rpm培養(yǎng)3h左右。 （2）然后向EP管中加入4～5倍體積的Buffer CP，用移液槍充分吹吸混勻后，再將其轉(zhuǎn)移到藍(lán)色的回收柱中。（2）將完全溶解的瓊脂糖倒入制膠模具，~ cm，然后迅速地在模具一端插上梳子，并檢查有無(wú)氣泡。（12）將上述離心所得洗脫液再重新加入到吸附柱中，室溫靜置5 min，12000 rpm離心2 min，即得到高質(zhì)量的基因組DNA。（4）向上述沉淀中加入200 μL溶液A，并用槍頭吹吸以充分懸浮沉淀，然后向懸浮液中加入20 μL（10 mg/mL）的RNaseA，并充分顛倒混勻，于室溫放置10 min。在HOM2基因外部的上下游分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物HAU和HAD及HBU和HBD，分別擴(kuò)增HOM2基因兩側(cè)非編碼區(qū)的片段HA和HB，用于同源重組敲除HOM2基因。（3）以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。升溫程序：起始柱溫設(shè)置為50℃，并以5℃ /min的升溫速度上升至80℃，然后再以10℃/min升溫升至150℃。（2）斐林試劑的標(biāo)定分別吸取斐林試劑甲液和乙液各5 mL，并置于150 mL三角瓶中，然后準(zhǔn)確地加入10 mL空白液（蒸餾水），%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液是在1 mL以內(nèi)，搖勻。 分析方法 CO2失重的測(cè)定黃酒發(fā)酵時(shí)，用帶有針孔的橡皮塞塞緊瓶口，置于30℃條件下靜置發(fā)酵，在黃酒發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h稱重一次，稱重前充分晃動(dòng)三角瓶中的發(fā)酵液以盡可能趕走瓶中CO2, 當(dāng)發(fā)酵失重小于1 g/12 h時(shí)，表明黃酒發(fā)酵已經(jīng)基本結(jié)束。（6）酚氯仿溶液按照25：24：1的體積比分別量取Tris飽和酚、氯仿、異戊醇，然后混合均勻，存放于棕色瓶?jī)?nèi)，并4℃保存。Brix，115℃、 min。（4）HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響。本課題的目的是在探討釀酒酵母高級(jí)醇代謝機(jī)理的基礎(chǔ)上，研究BATHOM2基因敲除以及BAT1和BAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響，為理論研究提供指導(dǎo)。高級(jí)醇是黃酒的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，適宜的高級(jí)醇含量及各種高級(jí)醇含量之間比例的協(xié)調(diào)可以使酒體豐滿圓潤(rùn)，口感柔和協(xié)調(diào)；如果高級(jí)醇含量過(guò)高，不但會(huì)給酒體帶來(lái)不愉快的異雜味，影響黃酒的品質(zhì)，而且有較強(qiáng)的致醉性，危害人的身體健康。Nissim[65]等人構(gòu)建的BAT1和BAT2基因敲除的突變株，其異丁醇的生成量顯著降低，但是沒有報(bào)導(dǎo)該突變株異戊醇的生成量及其發(fā)酵性能的變化情況。與傳統(tǒng)育種方法相比，基因工程育種具有針對(duì)性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定、周期性短等優(yōu)點(diǎn)，并克服了遠(yuǎn)源雜交不親和性，所以說(shuō)基因工程育種是一種非常優(yōu)越的育種方法。誘變育種的方法雖然簡(jiǎn)單易操作，但其缺點(diǎn)也是顯而易見的。 誘變育種誘變育種是一種有效而且容易操作的育種方法，常用于選育低產(chǎn)高級(jí)醇酵母菌株。嚴(yán)格控制黃酒發(fā)酵溫度，使其不能超過(guò)工藝要求，并降低發(fā)酵末期的溫度。武慶尉等[51]研究發(fā)現(xiàn)，酸性蛋白酶的添加量也能改變高級(jí)醇的生成量，適當(dāng)?shù)卦黾铀嵝缘鞍酌傅氖褂昧繒r(shí)，%，但是酸性蛋白酶的添加量過(guò)多時(shí)又會(huì)使高級(jí)醇的含量增加。若發(fā)酵溫度過(guò)高，那么酵母菌對(duì)氨基酸的脫氨基作用就會(huì)加速，同時(shí)還會(huì)加速酵母菌自溶產(chǎn)生大量氨基酸，由于發(fā)酵溫度過(guò)高造成的這兩種反應(yīng)都會(huì)增加高級(jí)醇的生成量。酵母菌在黃酒發(fā)酵過(guò)程中，能快速同化的氨基酸只有8種，但是酵母菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中需要的不僅僅是這8中氨基酸，所以酵母菌只能依靠自身合成那些不能被自身同化的氨基酸。 黃酒釀造原輔料黃酒發(fā)酵過(guò)程中，原料及微生物中蛋白質(zhì)的分解是氨基酸的主要來(lái)源。圖12 Ehrlich代謝途徑 Ehrlich pathway根據(jù)此反應(yīng)機(jī)制，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等都可以轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的高級(jí)醇。黃酒中的氨基酸含量豐富，賦予黃酒復(fù)雜的口感。對(duì)人體粘膜有刺激性作用的正丙醇對(duì)人體生理作用則和乙醇相近。黃酒中的高級(jí)醇主要有正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、 苯甲醇、β苯乙醇等[1112]，其中含量最高的是異戊醇和異丁醇，其次是正丙醇和苯乙醇[13]。隨著人們生活水平和物質(zhì)文化的日益提高，消費(fèi)者對(duì)黃酒產(chǎn)品的品質(zhì)要求也在不斷的提高和變化，包括黃酒的風(fēng)味口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等，特別是消費(fèi)者隨著對(duì)黃酒的認(rèn)識(shí)越來(lái)越高，對(duì)形成其風(fēng)味的微量成分也越來(lái)越重視。黃酒是一種集飲用與保健為一體的釀造酒，是我國(guó)重點(diǎn)發(fā)展和扶植的飲料酒之一。天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響畢業(yè)論文目 錄1 前 言 1 黃酒概述 1 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述 1 高級(jí)醇對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 2 酯類對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 3 其他類物質(zhì)對(duì)黃酒風(fēng)味的影響 3 黃酒發(fā)酵過(guò)程中高級(jí)醇的形成與控制 3 高級(jí)醇的形成機(jī)理 3 影響黃酒中高級(jí)醇含量的主要因素 6 降低黃酒中高級(jí)醇含量的主要措施 7 低產(chǎn)高級(jí)醇酵母菌株的研究進(jìn)展 8 誘變育種 8 細(xì)胞融合育種 9 基因工程育種 9 本課題的立題依據(jù)及研究?jī)?nèi)容 10 10 本課題的主要研究?jī)?nèi)容 112 材料與方法 13 材料與儀器 13 主要試劑 13 主要實(shí)驗(yàn)儀器 14 菌種與質(zhì)粒 15 主要培養(yǎng)基 15 主要溶液 16 分析方法 17 CO2失重的測(cè)定 17 酒精度的測(cè)定 17 還原糖的測(cè)定 17 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測(cè)定 18 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 18 實(shí)驗(yàn)方法 19 引物設(shè)計(jì) 19 各目的基因片段的獲得 21 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 23 酵母轉(zhuǎn)化 25 G418抗性基因的去除 26 黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 263 結(jié)果與討論 28 BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 28 BAT1基因的驗(yàn)證 28 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 28 BAT1基因敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 30 BAT1基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 32 小結(jié)與討論 33 BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 33 BATBAT2基因雙敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 33 突變株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)性能的比較 34 BATBAT2基因雙敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 35 小結(jié)與討論 36 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 37 HOM2基因的驗(yàn)證 37 重組質(zhì)粒pUCHABK的構(gòu)建 38 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除的突變株的獲得及驗(yàn)證 40 HOM2基因一個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 41 遺傳標(biāo)記基因KanMX的去除 42 小結(jié)與討論 44 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 44 重組質(zhì)粒pUCHB1A1K的構(gòu)建 44 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除的突變株的獲得及驗(yàn)證 47 突變株與出發(fā)菌株生長(zhǎng)性能的比較 48 HOM2基因兩個(gè)等位基因敲除對(duì)黃酒酵母高級(jí)醇生成量的影響 49 小結(jié)與討論 504 結(jié) 論 515 展 望 526 參考文獻(xiàn) 537 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況 588 致 謝 591 前 言 黃酒概述黃酒是我國(guó)的民族特產(chǎn)，至今已經(jīng)有7千年的歷史，與啤酒、葡萄酒并稱為世界上三大最古老的釀造酒[1]。黃酒是傳統(tǒng)的養(yǎng)生保健佳品，目前的初步研究已經(jīng)表明，黃酒具有抗衰老、抗氧化、降膽固醇、降血壓、參與機(jī)體的代謝活動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)等功效[56]。但是，目前仍存在著一些問題制約著黃酒行業(yè)的快速發(fā)展，如消費(fèi)市場(chǎng)地域性限制沒有突破導(dǎo)致市場(chǎng)拓展艱難、業(yè)內(nèi)存在著無(wú)序競(jìng)爭(zhēng)從而導(dǎo)致黃酒價(jià)值低估身價(jià)降低、傳統(tǒng)觀念影響從而導(dǎo)致創(chuàng)新能力不夠以及過(guò)分強(qiáng)調(diào)傳統(tǒng)的黃酒釀造技術(shù)從而導(dǎo)致黃酒生產(chǎn)效率難以提高等。 高級(jí)醇對(duì)黃酒風(fēng)味的影響高級(jí)醇通常又被稱為雜醇油，是指具有三個(gè)碳原子以上的一元醇類物質(zhì)的總稱。黃酒中高級(jí)醇含量?jī)H次于異戊醇的是異丁醇，異丁醇的毒性雖然比異戊醇的毒性小，但是異丁醇含量過(guò)多也會(huì)刺激人的眼、鼻。黃酒中一些不愉快的味感部分來(lái)自于脂肪酸，所以黃酒中脂肪酸的含量以少一點(diǎn)為好。Ehrlich代謝機(jī)制隨著其后研究的不斷完善，現(xiàn)在可歸納為：釀酒酵母在酒精發(fā)酵過(guò)程中，氨基酸通過(guò)轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨作用將氨基轉(zhuǎn)移到α酮戊二酸上形成谷氨酸和α酮酸，α酮酸在脫羧酶催化作用下，經(jīng)脫羧成醛，醛再經(jīng)醇脫氫酶作用下還原為相應(yīng)的高級(jí)醇，反應(yīng)過(guò)程如圖12所示[3536]。圖13 Harris途徑 Harris pathway 影響黃酒中高級(jí)醇含量的主要因素影響黃酒中高級(jí)醇含量的因素有很多，如原輔料的成分及比例、發(fā)酵工藝的控制、酵母菌種及黃酒后處理工藝等，這些因素相互作用，共同決定黃酒中的高級(jí)醇含量[43]。 酵母菌種同化氨基酸的能力酵母菌吸收氨基酸的主要方式是主動(dòng)運(yùn)輸，如果酵母分泌的運(yùn)輸酶不同，那其同化的氨基酸也就不同[46]。一般情況下，如果改變發(fā)酵溫度，那么黃酒中高級(jí)醇的種類及數(shù)量也會(huì)發(fā)生改變，從而影響到各種高級(jí)醇之間的平衡[48]。發(fā)酵過(guò)程中，在保證酵母細(xì)胞量充足的情況下，減少其增殖倍數(shù)，這樣酵母細(xì)胞不但能迅速消耗糖分，而且能大大減弱對(duì)氨基酸的分解作用，這樣就能大大降低高級(jí)醇的生成量。選擇適宜的制曲工藝，經(jīng)選育得到優(yōu)良的曲霉菌種，以控制其產(chǎn)酶數(shù)量。根據(jù)酵