【正文】 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較將構(gòu)建好的BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3?bat1與出發(fā)菌株同時進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗，發(fā)酵過程中記錄CO2失重情況，發(fā)酵結(jié)束后測量發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?，蒸餾發(fā)酵液并測量其酒精含量，結(jié)果見表31所示。發(fā)酵結(jié)果說明敲除BAT1基因?qū)S酒酵母基本發(fā)酵性能無明顯影響。 圖35重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物 PCR rebinant fragment BAKanMXBBM：DL5000 DNA Marker；1：BAKanMXBB 突變株的獲得及驗證將重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物回收，然后通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段分別導(dǎo)入黃酒酵母單倍體RY1a1與RY1α3，通過BA片段和BB片段與酵母染色體上BAT1基因兩側(cè)的同源序列同時發(fā)生同源重組（圖36），從而整合到酵母染色體上并隨其一起復(fù)制，重組過程實現(xiàn)了BAT1基因被KanMX基因完全替換，從而實現(xiàn)BAT1基因的敲除，KanMX基因的引入使突變株產(chǎn)生G418抗性，可以作為篩選標(biāo)記。擴(kuò)增出的DNA片段均與預(yù)期大小一致（BA：277 bp；BB：317 bp；KanMX：1613 bp），說明PCR擴(kuò)增結(jié)果都正確。待培養(yǎng)出單菌落之后，將單菌落對應(yīng)點(diǎn)接到無抗性的YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板上，置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)2~4 d，挑取在無抗性YEPD平板上生長而在含G418抗性平板上不生長的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗證轉(zhuǎn)化子的KanMX基因是否去除。（2）轉(zhuǎn)化1）將1 mL鮭魚精DNA煮沸5 min，并快速在冰上冷卻。 酶切載體的去磷酸化選用牛小腸堿性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）對酶切回收后的載體進(jìn)行去磷酸化處理，如表28，去磷酸化體系按照60 μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行。5）將上一步離心得到的上清液轉(zhuǎn)入吸附柱中，并在室溫下放置2 min，12000 rpm離心1 min之后，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進(jìn)收集管中。3）棄除上清，剩余大約50 μL液體，用移液槍吹打混勻菌體。放置于70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?（8）12000 rpm離心1 min，離心管內(nèi)的溶液即為純化的DNA溶液，20℃保存 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化（1）感受態(tài)細(xì)胞的制備采用TAKARA的Competent Cell Preparation Kit制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：1）取70℃保存的大腸桿菌DH5α在LB平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。 PCR產(chǎn)物純化回收采用OMEGA公司的DNA Back純化回收試劑盒進(jìn)行PCR、酶切反應(yīng)后的純化回收。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證。（10）12000 rpm離心2 min，將吸附柱敞口放置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，其目的是將吸附柱中殘留的漂洗液除去，否則殘留漂洗液中的乙醇會影響到后續(xù)的實驗，如酶切、PCR等。（2）取適量酵母菌液（不超過5107 cells） mL EP管中，12000 rpm離心1 min，盡量去除上清；向菌體中加入470 μL山梨醇Buffer，充分懸浮酵母菌體，再加入25 μL酵母破壁酶及5 μL β巰基乙醇，上下顛倒充分混勻，30℃溫度下放置1~2 h。BATBAT2基因雙敲除突變株的驗證和BAT1基因單敲除突變株的驗證相同。 生長曲線的測定（1）取斜面菌種一環(huán)接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，30℃條件下靜置培養(yǎng)12 h。進(jìn)樣量條件：1 μL的進(jìn)樣量，并設(shè)置為20：1的分流比。 還原糖的測定[75]利用斐林試劑法測定發(fā)酵液中還原糖的含量。（12）高級醇混標(biāo)溶液分別準(zhǔn)確量取色譜純的正丙醇、 mL、 mL mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 mL，得到高級醇的混標(biāo)母液，4℃冷藏。（4）100 mg/mL氨芐青霉素溶液稱取10 g氨芐青霉素，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。（3）半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)基半乳糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，蒸餾水配制，pH自然，121℃、 min。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHABK，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HAKanMXHB導(dǎo)入黃酒酵母二倍體出發(fā)菌株中，篩選得到HOM2基因一個等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因一個等位基因敲除的突變株與二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗，研究HOM2基因一個等位基因的敲除對黃酒酵母二倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。本實驗室前期實驗過程中，郝欣等人構(gòu)建了BAT2基因敲除突變株，該突變株進(jìn)行酒精濃醪發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，突變株的基本發(fā)酵性能與出發(fā)菌株基本相同，產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了55%和34%；戴龍海等人構(gòu)建了BAT2基因敲除單倍體菌株，該突變株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗的結(jié)果表明，突變株產(chǎn)異丁醇和異戊醇的含量分別降低了37%和12%左右，同時，敲除BAT2基因?qū)S酒酵母菌株的基本發(fā)酵性能無明顯影響。 本課題的立題依據(jù)及研究內(nèi)容黃酒是我國的民族特產(chǎn)，深受廣大人民群眾的喜愛。Yoshimoto[63]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變株發(fā)酵生成異丁醇和異戊醇的產(chǎn)量分別降低了72%和40%。細(xì)胞融合育種存在過程比較繁瑣且得到的目的菌株后代會出現(xiàn)性狀分離等缺點(diǎn)，因而限制了該技術(shù)在工業(yè)育種方面的應(yīng)用。趙樹欣[57]等人利用離子注入與紫外誘變經(jīng)二重誘變篩選得到的突變株，%。 低產(chǎn)高級醇酵母菌株的研究進(jìn)展在酵母發(fā)酵過程中，可以通過優(yōu)化釀酒工藝來控制高級醇的生成，而基于代謝控制理論，通過影響或者改變酵母菌株的代謝途徑，從根本上降低高級醇的生成，不但可以降低生產(chǎn)成本，還能提高黃酒的品質(zhì)。以較低溫度浸漬較長時間，以使原料中的部分蛋白質(zhì)因分解而被除去。當(dāng)發(fā)酵醪中糖化能力不能滿足酵母所需時，為加快其糖化速度可以加入一定量的糖化酶，使發(fā)酵醪中糖化力與酵母的發(fā)酵力達(dá)到平衡，這樣就加快了酵母的發(fā)酵速度。 發(fā)酵溫度在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度是酵母菌參與生化反應(yīng)的非常重要的外界因素。因此發(fā)酵醪中的碳氮比控制在能滿足酵母菌的需要的范圍內(nèi)，這樣能夠防止生成過多的高級醇。此后的研究中，正丙醇、異戊醇和活性戊醇的合成代謝途徑也陸續(xù)被提出并最終得到證明，總的反應(yīng)途徑如圖13所示。隨后，Lampitt[30]，Yamada[31]，Thorne[3233]，Ingraham[34]等進(jìn)一步研究證實氨基酸的分解代謝生成各種高級醇。 表12 黃酒中主要酯類及其顯味特征Table 12 Main esters in yellow rice wine and their characteristics of flavor 酯類顯味特征乙酸乙酯香蕉、蘋果香，味辣帶澀，味淡乳酸乙酯香氣弱，味微苦，適量有濃厚感，多則帶澀辛酸乙酯似梨香、菠蘿香，蘋果味帶甜己酸乙酯似菠蘿香，味甜爽口，大曲酒香，有愉快氣味乙酸異戊酯梨香，香蕉油香，蘋果味琥珀酸二乙酯微弱并令人愉快的香氣 其他類物質(zhì)對黃酒風(fēng)味的影響黃酒中的酸是黃酒風(fēng)味中重要的呈味物質(zhì)，含酸量過低，味淡，酒體不協(xié)調(diào)；含酸量過高，會影響酒體的整體風(fēng)味。尤其是異戊醇含量過高時，由于造成人體神經(jīng)系統(tǒng)充血，而使人產(chǎn)生惡心、嘔吐、頭疼等中毒癥狀。其中，高級醇和酯類是黃酒中最重要的兩類風(fēng)味物質(zhì)，對促進(jìn)黃酒酒體豐滿、濃厚，并增加酒的協(xié)調(diào)性起著重要作用。2013年18月，全國規(guī)模以上的黃酒企業(yè)銷售額同比增加8%，利潤增加19%左右，較其他酒種相對穩(wěn)定。黃酒除了直接飲用外，還可以入藥，也可以入饌來去腥增香。黃酒由于具有悠久的歷史、豐富的營養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味、酒精度低等特點(diǎn)[2]，所以受到廣大人民群眾的喜愛。我國從實行改革開放的政策以來，黃酒行業(yè)的發(fā)展速度較快。傳統(tǒng)的黃酒產(chǎn)品介紹與宣傳已經(jīng)開始制約著消費(fèi)群體的進(jìn)一步快速擴(kuò)大，同時也制約著地域性市場的進(jìn)一步拓展。高級醇是黃酒釀造過程中不可避免的重要副產(chǎn)物，是構(gòu)成黃酒酒體的重要成分。黃酒中高級醇含量過高對人體有毒害作用這一點(diǎn)已經(jīng)引起了消費(fèi)者和生產(chǎn)者的高度重視，而且目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的[18]，因此采取安全有效的解決措施，達(dá)到控制黃酒中的高級醇含量在適宜的范圍內(nèi)，對提高黃酒的品質(zhì)和地位、以及進(jìn)一步擴(kuò)展黃酒市場具有重要意義。黃酒中含糖量的多少也能夠影響黃酒的品質(zhì)，黃酒中含有一定量的糖能夠賦予酒體醇厚感和愉快感，而含糖量過低的酒，其口感往往會比較粗糙。各種氨基酸與相應(yīng)的高級醇之間的關(guān)系見表13。原輔料中含有豐富的蛋白質(zhì)，主要包括釀造用米和制曲用小麥等，這些物質(zhì)為黃酒釀造提供了大量的蛋白質(zhì)。酵母菌要合成那些不能被自身同化的氨基酸時，由糖代謝途徑提供所需要的酮酸，而α氨基氮來自于能被酵母快速同化的8種氨基酸（經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶脫下）。所以通過降低發(fā)酵末期的溫度，抑制酵母菌的活動能力，可以降低高級醇生成量。在黃酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵醪中酵母細(xì)胞的總數(shù)控制在一定范圍內(nèi)，使其發(fā)酵力、糖化力及蛋白分解力三者達(dá)到平衡協(xié)調(diào)時，則能夠更有效的降低高級醇的含量。適當(dāng)增加酵母接種量并嚴(yán)格控制發(fā)酵醪中的溶氧。有多種方法可以對釀酒酵母進(jìn)行誘變處理，其中普遍采用的物理誘變方法為紫外線誘變，化學(xué)誘變方法有亞硝酸誘變、亞硝基胍誘變等。首先，誘變育種得到的菌株大多數(shù)都是營養(yǎng)缺陷型菌株，在其發(fā)酵過程中要向發(fā)酵液中補(bǔ)加維生素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，所以不利于工業(yè)化生產(chǎn)。結(jié)合酵母中高級醇生成的兩條代謝途徑，許多科學(xué)家對降低釀酒酵母生成高級醇的含量，尤其是降低其生成異丁醇和異戊醇的含量進(jìn)行了大量且深入的研究。丙酮酸脫羧酶是氨基酸分解代謝途徑中催化α酮酸脫羧成醛的關(guān)鍵酶，Yoshimoto[66]等人構(gòu)建了編碼丙酮酸脫羧酶的PDC1基因缺失的突變株，其異戊醇的生成量下降了31%。目前的檢測數(shù)據(jù)顯示，在所有釀造酒中，黃酒中高級醇的含量是最高的。 本課題的主要研究內(nèi)容本課題擬從以下幾個方面展開研究：（1）BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCHB1A1K，通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段HA1KanMXHB1導(dǎo)入HOM2基因一個等位基因敲除的突變株中，篩選得到HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株，并將HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株與HOM2基因一個等位基因敲除的突變株及二倍體出發(fā)菌株進(jìn)行黃酒發(fā)酵實驗，研究HOM2基因兩個等位基因的敲除對黃酒酵母二倍體菌株高級醇生成量及基本發(fā)酵性能的影響。（5）黃酒發(fā)酵培養(yǎng)基500 mL三角瓶中加入100 g大米（蒸熟并攤涼），10 g麥曲，45 mL米漿水（PH ），60 mL清水，30 mL二級種子液。（7）50TAE緩沖液分別取242 gTris， mL冰醋酸，和100 mL mol/L的Na2EDTA（pH ），然后用蒸餾水溶解并最終定容至1 L。 酒精度的測定利用酒精計比重法測定酒精度[74]。在電爐上加熱至沸騰，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液滴定直至藍(lán)色消失，此滴定操作過程要求操作準(zhǔn)確并且迅速，需要在1 min以內(nèi)完成，%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積。（2）樣品預(yù)處理 mL至10 mL容量瓶中，并用發(fā)酵液蒸餾所得酒樣定容，混勻后， mL加入到自動進(jìn)樣瓶中，然后進(jìn)行氣相分析。 實驗方法 引物設(shè)計本實驗中所用全部引物序列見表24。在HA片段的上游設(shè)計引物HS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計引物KS1用于HOM2基因一個等位基因敲除的突變株的上游驗證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計引物KX1和在HB片段的下游設(shè)計引物HX用于HOM2基因一個等位基因敲除的突變株的下游驗證。（5）然后加入20 μL（10 mg/mL）的蛋白酶K，并充分顛倒混勻，在65℃水浴中消化15~30min，消化期間可以顛倒混勻數(shù)次，直到樣品完全消化為止。 各基因片段的PCR擴(kuò)增（1）PCR反應(yīng)體系加樣量如表25。（3）室溫條件下放置30~45 min，直到瓊脂糖溶液完全凝固，小心地拔出梳子后，將凝膠放置于電泳槽中。 （3）12000 rpm離心1 min后，倒掉收集管中的廢液。4）將菌液立即放置于冰上預(yù)冷10 min，4℃，5000 rpm離心5 min，棄除上清，收集大腸桿菌的菌體沉淀。3）冰浴后42℃熱激90 s，并迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2 min。（2）采用solarbio質(zhì)粒小提試劑盒精提。8）12000 rpm空甩2 min，丟掉收集管，并將吸附柱敞口放置于室溫下數(shù)分鐘。 質(zhì)粒載體與目的片段的連接 質(zhì)粒載體與目的片段進(jìn)行連接的體系見表29：表29 連接體系Table 29 Components of ligation system組分加樣量載體DNAx μL目的片段y μLSolution I5 μL反應(yīng)條件：載體與目的片段的摩爾比為1:31:10，16℃恒溫條件下連接過夜。5）42℃水浴中熱激40 min。（3）二級種子培養(yǎng)：取一級種子液2 mL接種到裝有100 mL麥汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，30℃靜置培養(yǎng)24 h。將KanMX基因片段用BamHI進(jìn)行單酶切，與經(jīng)同樣酶切并去磷酸化回收的pUCBAB質(zhì)粒連接，最終構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK。圖36 BAKanMXBB片段與黃酒酵母基因組同源重組過程 Double homologous rebination between BAKanMXBB cassette and BAT1 gene in yellow wine yeast挑取G418平板上長出的轉(zhuǎn)化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并提取其基因組，然后以此基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR驗證