【正文】 母菌生成高級醇的兩條代謝途徑，人們對高級醇的形成及其代謝調(diào)控做了更進(jìn)一步的研究，并且由此產(chǎn)生了一些能夠降低發(fā)酵過程中高級醇生成量的思路和方法。Ingraham[34]等人選育出了亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株，該突變株發(fā)酵產(chǎn)異戊醇的含量降低了95%，但由于該突變株需要在富含亮氨酸的培養(yǎng)基中生長，而且其發(fā)酵性能也明顯降低，所以限制了該菌在工業(yè)上的應(yīng)用。 基因工程育種基因工程育種指的是利用分子生物學(xué)手段在分子水平上按照人們的意愿對菌株進(jìn)行有目的的改造，從而提高有利發(fā)酵產(chǎn)物的生成量或者降低不利發(fā)酵產(chǎn)物的生成量。Lilly[64]等人的研究結(jié)果表明，BAT2基因缺失突變菌株發(fā)酵生成異丁醇的含量顯著下降。人們的生活水平和物質(zhì)文化日益提高，同時消費(fèi)者對黃酒這種消費(fèi)品的品質(zhì)要求也在不斷提高和變化，包括黃酒的風(fēng)味口感和營養(yǎng)價值等，特別是消費(fèi)者隨著對黃酒的認(rèn)識越來越高，對形成其風(fēng)味的微量成分也越來越重視。以上結(jié)果顯示，BAT2基因敲除對異丁醇的生成量有顯著影響，對黃酒中含量最高的異戊醇的生成量影響不太顯著，而對正丙醇則沒有影響，本課題將繼續(xù)研究高級醇代謝途徑中的相關(guān)基因?qū)Ω呒壌忌闪康挠绊憽Ｈ缓?，利用Cre/LoxP系統(tǒng)去除HOM2基因一個等位基因敲除的突變株中引入的KanMX標(biāo)記基因。（4）麥汁培養(yǎng)基稱取一定量粉碎的麥芽，按1：5的料水比于65℃水浴鍋中糖化34 h至碘檢完畢，然后經(jīng)過過濾、煮沸、過濾，并用糖度計調(diào)整外觀糖度至13176。（5）G418 溶液稱取10 g G418，用蒸餾水溶解并最終定容至100 mL，得到濃度為100 mg/mL的母液， μm濾膜過濾除菌， mL EP管分裝, 20℃保存。（13）%內(nèi)標(biāo)液 mL，然后用濃度為60%的乙醇溶液定容至10 %（V/V）的內(nèi)標(biāo)液，4℃冷藏。（1）原理以次甲基藍(lán)作為指示劑，用試液滴定煮沸著的斐林試劑，終點時微過量糖液會將藍(lán)色的指示劑次甲基藍(lán)還原成無色的還原態(tài)，最后根據(jù)試液的用量可以求得還原糖的含量。載氣條件：載氣為高純氮，并將其流速設(shè)置為2 mL/min。（2）用全自動生長曲線分析儀測定菌株的生長曲線：接種量為2%～5%梯度接種，培養(yǎng)溫度為30℃，600 nm紫外光下測定吸光值，每隔1 h測定一次菌液的OD值。（2）HOM2基因一個等位基因敲除的突變株RY11的構(gòu)建及驗證所需引物根據(jù)GenBank報道的HOM2基因序列設(shè)計一對引物HOM2U和HOM2D，用于驗證黃酒酵母基因組中HOM2基因的存在。（3）12000 rpm離心1 min，棄除上清，并收集沉淀。（11） mL EP管中，然后向吸附膜中央懸空滴加50~200 μL預(yù)先經(jīng)過65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5 min，12000 rpm離心2 min。 瓊脂糖凝膠電泳（1）根據(jù)所需要的濃度（%~%）稱取一定量的瓊脂糖，然后加入一定量的1TAE電泳緩沖液，放入微波爐中加熱使瓊脂糖完全溶解。（1） mL EP管中，每管含量應(yīng)小于15 μg。2）挑接單菌落于含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃，200 rpm搖床中培養(yǎng)過夜。（2）轉(zhuǎn)化1）從70℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，并置于冰浴融化。4）向其中加入50 μL的酚氯仿溶液，并用渦旋振蕩器充分混勻。6）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液之后，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進(jìn)收集管中。表28 去磷酸化體系Table 28 Components of dephosphorylation system組分加樣量10Alkaline Phosphatase Buffer 6 μL質(zhì)粒 ≤1 μgCIAP（1 U/μL） 2 μLddH2O Add to 60 μL反應(yīng)條件：先37℃水浴30 min，然后再50℃水浴30 min。2）對于每一個轉(zhuǎn)化，都要小心按下列順序加入“轉(zhuǎn)化混合液”：PEG3350（50% m/v） 240 μL mol/L乙酸鋰 36 μLssDNA（ mg/mL） 50 μL轉(zhuǎn)化片段（～10 μg） 34 μL3）劇烈振蕩直到完全混勻。 黃酒發(fā)酵實驗 種子培養(yǎng)（1）菌種活化：取保存于甘油管中的酵母菌轉(zhuǎn)接至YEPD斜面上，30℃條件下培養(yǎng)兩天。 重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程如圖33，將純化的BA片段用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUC19質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBA。根據(jù)出發(fā)菌株已知的G418抗性臨界濃度，選用含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板篩選突變株。 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量的比較BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株黃酒發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液的蒸餾液進(jìn)行氣相色譜分析，檢測突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)高級醇的含量，結(jié)果見表32。利用引物BS和KSBAT1可從轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增出大小為1904 bp的上游驗證產(chǎn)物（圖37，泳道2），利用引物KXBAT1和BX可從轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增出大小為1188 bp的下游驗證產(chǎn)物（圖36，泳道4），而出發(fā)菌株則無擴(kuò)增產(chǎn)物(圖37，泳道1和3)，PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物大小與預(yù)期相同，此結(jié)果說明基因片段BAKanMXBB已經(jīng)成功整合到黃酒酵母染色體BAT1基因位點上，替代敲除了BAT1基因，即BAT1基因敲除單倍體突變株構(gòu)建成功，命名為RY1a1?bat1和RY1α3?bat1。將重組質(zhì)粒pUCBA經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，獲得2686 bp和277 bp大小的特異性條帶；將重組質(zhì)粒pUCBAB經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，獲得2963 bp和317 bp大小的特異性條帶；將重組質(zhì)粒pUCBABK經(jīng)BamHI單酶切，獲得3280 bp和1613 bp大小的特異性條帶，這些片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致，基本證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，然后將質(zhì)粒送往測序公司進(jìn)行基因測序，結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，其中KanMX與BA和BB連接方向相反。發(fā)酵期間每隔12 h稱重一次，發(fā)酵結(jié)束后測定酒精度、殘?zhí)堑然景l(fā)酵性能及高級醇的含量。7）離心去除上清液，用200～500 μL無菌水重新懸浮菌體，然后取適量菌液涂布G418抗性YEPD平板，培養(yǎng)2~3 d后挑取能夠正常生長的轉(zhuǎn)化子。2）將上述過夜培養(yǎng)的菌液接種至裝有50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為2107個/mL（3～5 h），此時菌體處于對數(shù)期。10）為了增加質(zhì)粒的回收率，可以將上步離心得到的洗脫液重新滴加到吸附柱中，并在室溫下放置5 min，12000 rpm離心1 min。2）向留有菌體沉淀的EP管中加入250 μL溶液I，并用移液槍充分懸浮菌體沉淀。6）挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行酶切和電泳驗證。6）4℃，4000 rpm離心5 min，然后盡量去除上清液。 （5）13000 rpm空甩2 min后，棄掉收集管。（5）取一定量的DNA樣品與適量的6上樣緩沖液混合均勻，然后用移液槍加入到樣品孔中。mol/L) 1 μL下游引物(10 181。（7）12000 rpm離心2 min，棄掉廢液，然后將吸附柱重新放入收集管中。在HA1片段的上游設(shè)計引物HS和在KanMX序列內(nèi)部設(shè)計引物KS2用于HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株的上游驗證，在KanMX基因內(nèi)部設(shè)計引物KX2和在HB1片段的下游設(shè)計引物HX用于HOM2基因兩個等位基因敲除的突變株的下游驗證。在BAT1基因外部的上下游分別設(shè)計一對引物BAU和BAD及BBU和BBD，分別擴(kuò)增BAT1基因兩側(cè)非編碼區(qū)的片段BA和BB，用于同源重組敲除BAT1基因。先進(jìn)樣需要檢測的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，可測得各物質(zhì)的保留時間。（4）計算式中：Vo—空白液所消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積（mL）；V—樣品稀釋液所消耗的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積（mL）；C—標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度（g/L）n—樣品的稀釋倍數(shù)Vs—所取樣品稀釋液的體積（mL） 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的測定采用氣相色譜法[7577]測定黃酒發(fā)酵液的蒸餾液中高級醇含量，采用的是內(nèi)標(biāo)法，乙酸正戊酯作為內(nèi)標(biāo)。同時為了防止酒精揮發(fā)，在蒸餾過程中應(yīng)使量筒始終處于冰浴中。（9）PEG3350（50％，w/v）稱取25 g PEG3350，然后用蒸餾水定容至50 mL，115℃滅菌15 min。 主要溶液（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取經(jīng)過105℃ g，然后用蒸餾水溶解，再加入5 mL的濃鹽酸，最終用蒸餾水定容至1 L。表21 實驗試劑Table 21 Reagents used in this work試劑生產(chǎn)廠家葡萄糖天津市化學(xué)試劑一廠蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)公司酵母浸粉北京奧博星生物技術(shù)公司胰蛋白胨天津市化學(xué)試劑一廠氯化鈉天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠無水乙醇天津市江天化工技術(shù)有限公司G418北京索萊寶科技有限公司氨芐霉素上海生工生物有限公司氫氧化鈉天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠濃鹽酸天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠濃硫酸天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠PEG3350北京索萊寶科技有限公司鮭魚精DNA北京索萊寶科技有限公司醋酸鋰天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠Tris平衡酚北京索萊寶科技有限公司氯仿天津化學(xué)試劑有限公司異戊醇天津化學(xué)試劑有限公司硫酸銅天津化學(xué)試劑有限公司次甲基藍(lán)天津化學(xué)試劑有限公司酒石酸鉀鈉天津化學(xué)試劑有限公司亞鐵氰化鉀天津化學(xué)試劑有限公司丙三醇天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠SDS天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠酵母破壁酶北京索萊寶科技有限公司RNaseA北京索萊寶科技有限公司蛋白酶K北京索萊寶科技有限公司LATaqTaKaRa中國大連公司Solution ITaKaRa中國大連公司DL5000 MarkerTaKaRa中國大連公司乙酸正戊酯天津光復(fù)精細(xì)化工研究所正丙醇天津光復(fù)精細(xì)化工研究所異丁醇天津光復(fù)精細(xì)化工研究所異戊醇天津光復(fù)精細(xì)化工研究所 主要實驗儀器 本論文所用實驗儀器如表22所示。（2）BATBAT2基因雙敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響。利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)降低黃酒中高級醇含量是我國黃酒釀造行業(yè)重要的研究課題。醇脫氫酶是高級醇形成途徑中催化醛類還原形成高級醇的重要酶，Atsumi[70]等人指出ADH2基因編碼的醇脫氫酶是催化異丁醛和異戊醛形成異丁醇和異戊醇的關(guān)鍵性酶，通過過量表達(dá)ADH2基因，顯著提高了異丁醇和異戊醇的生成量。n[60]，Kispal[61]和Eden[21]等人對酵母中支鏈氨基酸分解生成高級醇的代謝途徑進(jìn)行了大量深入的研究，他們的研究成果表明，該途徑的第一步反應(yīng)為支鏈氨基酸的轉(zhuǎn)氨作用，該反應(yīng)是由支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶控制的，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶分為線粒體支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞質(zhì)支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶兩種，且分別由BAT1基因和BAT2基因編碼，釀酒酵母中，BAT1基因編碼的線粒體支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶在其對數(shù)生長期活性很高，但是在穩(wěn)定期活性較低；而BAT2基因編碼的細(xì)胞質(zhì)氨基酸轉(zhuǎn)氨酶在其穩(wěn)定期活性很高，但在對數(shù)期活性較低[6162]。 細(xì)胞融合育種細(xì)胞融合又稱為原生質(zhì)體融合，該技術(shù)也常用于選育酵母菌種。因此，根據(jù)代謝控制原理，選育分支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型菌株，由于其不能合成相應(yīng)的氨基酸合成途徑中的某些酶尤其是和高級醇的生成有關(guān)的酶，因而減少了α酮酸的積累，由于α酮酸是合成高級醇的前體物，所以達(dá)到了降低高級醇生成量的目的。（1）黃酒中高級醇分子的直徑一般比酒中其他主要成分分子的直徑大，根據(jù)這一特點，可以利用濾膜裝置來截留分子直徑較大的高級醇分子[52]。 降低黃酒中高級醇含量的主要措施 選育低產(chǎn)高級醇黃酒酵母菌株即使在相同的釀造工藝條件下，不同的黃酒酵母菌株由于其生理代謝活動的不同，所以其發(fā)酵過程中生成高級醇的含量也會存在極大的差異。但是酵母菌在有氧條件和無氧條件下的生理代謝活動是不同的，酵母菌在高含氧量條件下比在低含氧量條件下的生長代謝旺盛。 因此黃酒中高級醇的含量及種類也與酵母菌同化不同氨基酸的能力有關(guān)。 在整個黃酒釀造過程中，氨基酸的含量是一個動態(tài)過程，其原因主要為以下兩個方面：一是酵母菌等微生物的生長繁殖需要消耗氨基酸，二是在蛋白酶的作用下蛋白質(zhì)可以不斷水解為氨基酸。Harris于1953年提出了高級醇由糖代謝通過丙酮酸的合成途徑[37]。在正常發(fā)酵液中生成的高級醇總量，75%是由糖代謝產(chǎn)生的，另外25%來源于Ehrlich途徑[2627]。黃酒中的酯類物質(zhì)種類豐富，包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸異戊酯等，其中含量最高的是乳酸乙酯和乙酸乙酯，占酯類物質(zhì)總量的85%以上[19]。適宜的高級醇含量能給人以柔和、醇厚、圓潤、豐滿及協(xié)調(diào)的感覺。 黃酒風(fēng)味物質(zhì)概述黃酒獨(dú)特的生產(chǎn)工藝賦予了其豐滿、醇和、柔順、圓潤、濃郁、悠長的感覺，也賦予了其醇、香、柔、爽的獨(dú)特風(fēng)味[7]。2006年至2010年， 萬千升，合計增長110%，年平均復(fù)合增長率為20%。黃酒是一種高營養(yǎng)性的飲料酒，所以又被譽(yù)為“液體蛋糕”。黃酒中富含的營養(yǎng)物質(zhì)有氨基酸、糖、肽等，其中黃酒中的氨基酸不僅種類高達(dá)20種之多，而且其含量非常豐富，其中人體必需的8種氨基酸含量，居釀造酒之首。黃酒行業(yè)龍頭骨干不斷做大做強(qiáng)，發(fā)展迅速。黃酒這種獨(dú)特的風(fēng)味特征，是眾多風(fēng)味物質(zhì)綜合反應(yīng)的集中體現(xiàn)。所以黃酒中的高級醇含量不宜過低或過高：若過低，酒味淡，酒體不豐滿；若過高，不但造成酒體有不愉快的異雜味，還會有較強(qiáng)的致醉性，也就是人們俗稱的“上頭”[1417]。中低沸點酯類的含量是隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行而不斷增加的，而高級酯類則增加的