【正文】 的橡皮塞塞緊瓶口，置于30℃條件下靜置發(fā)酵，在黃酒發(fā)酵過程中每隔12 h稱重一次，稱重前充分晃動三角瓶中的發(fā)酵液以盡可能趕走瓶中CO2, 當發(fā)酵失重小于1 g/12 h時，表明黃酒發(fā)酵已經(jīng)基本結(jié)束。當量筒中蒸餾液滴至98 mL左右時停止蒸餾，然后再用蒸餾水補足至100 mL即可。（2）斐林試劑的標定分別吸取斐林試劑甲液和乙液各5 mL，并置于150 mL三角瓶中，然后準確地加入10 mL空白液（蒸餾水），%標準葡萄糖溶液，%標準葡萄糖溶液是在1 mL以內(nèi)，搖勻。（1）色譜條件氣相色譜儀為Agilent 7890C，并且配置有Agilent G4512A自動進樣器，色譜柱為 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 30 m320 μm μm ，檢測器為FID。升溫程序：起始柱溫設(shè)置為50℃，并以5℃ /min的升溫速度上升至80℃，然后再以10℃/min升溫升至150℃。然后再進酒樣進行檢測，就可以根據(jù)各物質(zhì)的保留時間初步定性酒樣中需要檢測的各物質(zhì)。（3）以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。根據(jù)質(zhì)粒pUG6序列設(shè)計一對引物KU和KD擴增KanMX基因，作為抗性篩選標記。在HOM2基因外部的上下游分別設(shè)計一對引物HAU和HAD及HBU和HBD，分別擴增HOM2基因兩側(cè)非編碼區(qū)的片段HA和HB，用于同源重組敲除HOM2基因。表24 PCR反應(yīng)引物Table 24 PCR primers used in this studyPrimer nameSequence (5′→3′)Restriction siteBAT1U5′ CATGTTGCAGAGACATTCCTTG3′NoneBAT1D5′ CATTAGTTCAAGTCGGCAACAG3′NoneBAU5′CCGGAATTCATACCGGCTGTCGCTATTATTACTG3′EcoRIBAD5′CGCGGATCCCAACTTCAAGGAATGTCTCTGCAAC 3′BamHIBBU5′CGCGGATCCGTAACTGGTCAAAAACTGTTGCCGA3′BamHIBBD5′TGCACTGCAGCAGCGAGATACCTTGGCAACTAAAT3′PstIBS5′GCATATCTGCTCAAGTAGACAAGG3′NoneKSBAT15′GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA3′NoneKXBAT15′CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC3′NoneBX5′CTGTATGCCACGATGATGGAAGG3′NoneHOM2U5′ TGGGTGCTACTGGTTCCGTTGGT3′NoneHOM2D5′ GGCAATCAAGACACCAGAACCAGC3′NoneHAU5′CCCAAGCTTGCAGCAGCCTTGCCCTTTTACAC3′Hind III HAD5′CGCGGATCC ACCAACGGAACCAGTAGCACCCA 3′BamHIHBU5′CGCGGATCC GGTTCTGGTGTCTTGATTGCCGAAATC3′BamHIHBD5′CGGGGTACCACAGTGCTATTGTGAGTGTATCCCAGC3′KpnIHS5′GCTAAACACGCCTGTGGTCATTC3′NoneKS15′CGGATAAAATGCTTGATGGTCGGA3′NoneKX15′CGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGT3′NoneHX5′GGAAGGCACTACTGAGCCAAATG3′NoneHA1U5′CCCAAGCTTGCTGGTGTTTTGGGTGCTACTG3′Hind III HA1D5′CGCGGATCCCGATAGCGCCAGCATAGTCAGC 3′BamHIHB1U5′CGCGGATCCCAAGAACAGACCTGCTCCATCC 3′BamHIHB1D5′CCGGAATTCATCAAGACACCAGAACCAGCGG3′EcoRIKS25′GGGCAATCAGGTGCGACAATCTA3′NoneKX25′CAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTC3′NoneKanU5′CGCGGATCCCAGCTGAAGC TTCGTACGC3′BamHIKanD5′CGCGGATCCGCATAGGCCACTAGTGGATCTG3′BamHIZeocinU5′ATCGTCGACCCCACACACCATAGCTTCA3′NoneZeocinD5′GCGGTCGACAGCTTGCAAATTAAAGCCTT3′None 各目的基因片段的獲得 酵母基因組DNA的提取采用solarbio酵母基因組DNA提取試劑盒提取。（4）向上述沉淀中加入200 μL溶液A，并用槍頭吹吸以充分懸浮沉淀，然后向懸浮液中加入20 μL（10 mg/mL）的RNaseA，并充分顛倒混勻，于室溫放置10 min。（8）向吸附柱中加入700 μL的漂洗液（在使用之前應(yīng)先檢查是否已經(jīng)加入無水乙醇），12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。（12）將上述離心所得洗脫液再重新加入到吸附柱中，室溫靜置5 min，12000 rpm離心2 min，即得到高質(zhì)量的基因組DNA。mol/L) 1 μL模板 μL/基因組1 μLLATaq酶 μLddH2O Add to 20 μL（2）PCR反應(yīng)條件見表26。（2）將完全溶解的瓊脂糖倒入制膠模具，~ cm，然后迅速地在模具一端插上梳子，并檢查有無氣泡。（6）接通電泳槽與電泳儀的電源，然后將電壓降選擇1~5 V/cm。 （2）然后向EP管中加入4～5倍體積的Buffer CP，用移液槍充分吹吸混勻后，再將其轉(zhuǎn)移到藍色的回收柱中。 （6）將吸附柱開蓋敞于室溫放置20 min左右，去除殘留乙醇。3）將上述培養(yǎng)菌液按1%的比例轉(zhuǎn)接至裝有200 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃，220 rpm培養(yǎng)3h左右。7）向菌體沉淀中加入40 mL冰浴的 Solution B，輕輕晃動以懸浮菌體沉淀，禁止劇烈振蕩浮。2）加入連接產(chǎn)物10 μL，輕輕混勻，冰浴30 min。 質(zhì)粒提?。?）粗提1）從LB平板上挑取單菌落于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃，200 rpm過夜培養(yǎng)。5）12000 rpm離心5 min以上，取其上清，進行電泳驗證。3）向EP管中加入250 μL溶液II，并溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，從而使菌體充分裂解。7）再向吸附柱中加入500 μL的漂洗液，然后12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放進收集管中。11）離心管中的液體即為提取的質(zhì)粒，20℃保存?zhèn)溆?。將去磷酸化后的產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物純化回收的步驟進行回收，然后置于20℃保存。3）將菌液轉(zhuǎn)至50 mL無菌離心管中，5000 rpm離心5 min，棄除上清液，再用25 mL無菌水洗滌兩次，并棄去上清；4）用1 mL mol/L的LiAc緩沖液重新懸浮酵母菌體， mL的EP管中。4）30℃恒溫箱中保溫30 min。 G418抗性基因的去除本研究擬采用CreLoxP報告基因挽救系統(tǒng)[8081]，來剔除報告基因KanMX。（2）一級種子培養(yǎng)：取活化的斜面菌種一環(huán)，接種于裝有5 mL麥汁培養(yǎng)基的試管中，30℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)12 h。3 結(jié)果與討論 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因的驗證以提取的黃酒酵母基因組為模板，以BAT1U和BAT1D為引物，通過PCR擴增出基因片段，電泳結(jié)果顯示PCR擴增產(chǎn)物較單一，特異性條帶大小為1182 bp，與BATI基因大小一致，證明黃酒酵母基因組上存在完整的BAT1基因（圖31）。將純化后的BB片段用BamHI和PstI 進行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUCBA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBAB。 圖34 重組質(zhì)粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK的酶切驗證 Restriction endonuclease analysis of rebinant plasmids pUCBA, pUCBAB and pUCBABKM：DL5000 DNA marker；1：pUCBA/EcoRIBamHI；2：pUCBAB/PstIBamHI；3：pUCBABK/BamHI BAT1基因敲除突變株的獲得及驗證 重組片段的獲得以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pUCBABK為模板，利用引物BAU和BBD擴增2207 bp的重組片段BAKanMXBB，電泳檢測目的片段，結(jié)果如圖35。若基因片段BAKanMXBB已整合到出發(fā)菌株的染色體中，則會在含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板上生長。圖37 BAT1基因敲除突變株的PCR驗證 PCR confirmation of mutant strain RY1a1?bat1M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1a1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進行PCR擴增的產(chǎn)物；2：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進行PCR擴增的產(chǎn)物；3：以RY1a1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進行PCR擴增的產(chǎn)物；4：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進行PCR擴增的產(chǎn)物 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較將構(gòu)建好的BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3?bat1與出發(fā)菌株同時進行黃酒發(fā)酵實驗，發(fā)酵過程中記錄CO2失重情況，發(fā)酵結(jié)束后測量發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?，蒸餾發(fā)酵液并測量其酒精含量，結(jié)果見表31所示。表32 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量比較Table 32 Higher alcohols production of BAT1 mutant strains and parent strains菌株正丙醇（mg/L）異丁醇（mg/L）異戊醇（mg/L）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，出發(fā)菌株RY1a1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/ mg/L，突變株RY1a1?bat1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/。發(fā)酵結(jié)果說明敲除BAT1基因?qū)S酒酵母基本發(fā)酵性能無明顯影響。根據(jù)釀酒酵母基因組上重組位點兩端的基因序列和插入片段的序列，分別設(shè)計兩組上下游引物BS和KSBATKXBAT1和BX用以驗證轉(zhuǎn)化子。 圖35重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物 PCR rebinant fragment BAKanMXBBM：DL5000 DNA Marker；1：BAKanMXBB 突變株的獲得及驗證將重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物回收，然后通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段分別導(dǎo)入黃酒酵母單倍體RY1a1與RY1α3，通過BA片段和BB片段與酵母染色體上BAT1基因兩側(cè)的同源序列同時發(fā)生同源重組（圖36），從而整合到酵母染色體上并隨其一起復(fù)制，重組過程實現(xiàn)了BAT1基因被KanMX基因完全替換，從而實現(xiàn)BAT1基因的敲除，KanMX基因的引入使突變株產(chǎn)生G418抗性，可以作為篩選標記。 圖32 BA、BB和KanMX基因片段的PCR產(chǎn)物 PCR product of BA, BB and KanMX fragmentM：DL5000 DNA Marker；1：BA；2：BB；3：KanMX圖33 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程圖 Construction of rebinant plasmid pUCBABK 重組質(zhì)粒的驗證根據(jù)重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程，分別將重組質(zhì)粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK進行酶切驗證，電泳結(jié)果如圖34。擴增出的DNA片段均與預(yù)期大小一致（BA：277 bp；BB：317 bp；KanMX：1613 bp），說明PCR擴增結(jié)果都正確。 黃酒發(fā)酵將30 ml二級種子液接種到加有100 g 大米（煮熟并攤涼）、10 g麥曲、45 mL米漿水和60 mL清水的500 mL直口三角瓶內(nèi)，塞上插有針孔的橡膠塞，置于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d。待培養(yǎng)出單菌落之后，將單菌落對應(yīng)點接到無抗性的YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板上，置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)2~4 d，挑取在無抗性YEPD平板上生長而在含G418抗性平板上不生長的菌落進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證轉(zhuǎn)化子的KanMX基因是否去除。6）13000 rpm離心30 s，去除上層轉(zhuǎn)化液，然后加入1 ml YEPD重新懸浮菌體，30℃100 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。（2）轉(zhuǎn)化1）將1 mL鮭魚精DNA煮沸5 m