蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)-資料下載頁
2025-08-16 00:45本頁面
【正文】 方法 ?超過濾法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 兩種親水性高分子或一種高分子聚合物與一種鹽溶液混合后，因 疏水性差異 而分層。 不同的蛋白質(zhì) 在疏水層的溶解能力不同 而被萃取 。 ? 目前主要采用兩種體系 – 聚乙二醇 － 葡聚糖 – 聚乙二醇 － 磷酸 鉀 ?雙水相萃取法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 由于 蛋白質(zhì)表面電荷性質(zhì)、疏水性質(zhì)不同 ，用有機(jī)溶劑、表面活性劑、水構(gòu)成的反相膠束提取某些蛋白質(zhì)。 ? 將表面活性劑溶解于有機(jī)溶劑中，等體積加入到蛋白質(zhì)水溶液內(nèi)，混合后可使某些蛋白質(zhì)萃取到反相膠束內(nèi)。 ?反相膠束萃取法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 最常用的是 二氧化碳 ，在 ， CO2處于液體狀態(tài)，溫度為 176。 C， 當(dāng)壓力或溫度發(fā)生改變時， CO2處于氣－液中間態(tài)，具有溶劑性能，可以使許多蛋白質(zhì)及有機(jī)物質(zhì)溶解在某一狀態(tài)。經(jīng)過泵出、升溫等步驟即可分離出來。 ?超臨界流體萃取法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ?超臨界流體萃取法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 此法是利用 離子交換樹脂 作為柱層析支持物，將 帶有不同電荷 的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離的方法。 ? 離子交換樹脂可以分為陽離子交換樹脂（如羧甲基纖維素等），陰離子交換樹脂（如二乙基氨基乙基纖維素等）。 ? 帶 正電荷多 的蛋白質(zhì)與樹脂 結(jié)合較強(qiáng) ，而帶正電荷少的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合則較弱。 用不同濃度的陽離子洗脫液，如 NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過 Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 ?離子交換層析法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ?離子交換層析法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 此法又稱為 分子篩層析、分子排阻層析 。凝膠過濾所用的介質(zhì)是由交聯(lián)葡萄糖、瓊脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝膠珠。凝膠珠的 內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 。 ? Sephadex葡聚糖凝膠 G10G200 ? Sepharose瓊脂糖凝膠 2B,4B,6B ? Sephacryl丙烯酰胺葡聚糖凝膠S100,S200,S300,S400 ?凝膠過濾法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ?凝膠過濾法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 利用 蛋白質(zhì)表面存在的疏水區(qū)域的強(qiáng)度、大小不同 ，而被吸附到連接有疏水基團(tuán)的層析介質(zhì)上。 ? 離子強(qiáng)度增大可增強(qiáng)吸附能力，因此常常在2mol/L或 3mol/LNaCl溶解樣品，洗脫時可通過降低鹽濃度、增加乙二醇濃度進(jìn)行梯度洗脫。 ? 正丁基 Sepharose、 ? 正辛基 Sepharose ? 苯基 Sepharose ?疏水層析 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 這是一種高效分離純化蛋白的方法。其原理是 不同的蛋白質(zhì)分子對于固定化在載體上的特殊配基具有不同的識別和結(jié)合能力 。 ? 選擇與待純化蛋白質(zhì)具有特殊識別和結(jié)合作用的配基，然后應(yīng)用化學(xué)方法將該配基與載體共價連接。 ? 將這種連接有配基的載體裝入層析柱中，當(dāng)含有待純化的蛋白質(zhì)溶液通過層析柱時，該蛋白質(zhì)即與配基發(fā)生特異性結(jié)合而被吸附在層析柱上 ，而其它蛋白質(zhì)則流出柱外。被特異性結(jié)合在層析柱上的蛋白質(zhì)，可以用適當(dāng)?shù)呐潴w洗脫液洗脫。 親和層析法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 常用的配基 有抗體、抗原、激素或受體蛋白、酶的底物和抑制劑等。 ? 層析柱載體 為瓊脂糖凝膠等。 親和層析法 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 在外電場的作用下，帶電顆粒將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱為 電泳 。 ? 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動，從而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)。 ? 在外加電場作用下， 帶電的蛋白質(zhì)顆粒在電場中移動的速度（ v） 取決于 電場強(qiáng)度 (E)，所帶的凈電荷 (q)以及 與介質(zhì)的摩擦系數(shù) (f)。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳 、 等電聚焦等 。 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? SDS（ 十二烷基磺酸鈉） 是一種 陰離子型表面活性劑 ，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約 1 ? 2比例結(jié)合。 ? 這樣，每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負(fù)電荷， 而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。由于所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大量的 負(fù)電荷 ，而且它們的電荷密度也大體相同，因此， E?q值接近一個常數(shù)。所以該法 主要利用了 蛋白質(zhì)分子量大小不同 而分離蛋白質(zhì) 。 ? 用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。 ?SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 2．蛋白質(zhì)的純化方法 ? 將兩性電解質(zhì) (pH39,或其它范圍的如 pH57)同蛋白質(zhì)樣品一起加入到已經(jīng)鋪好的凝膠上， 在電場下，兩性電解質(zhì)首先達(dá)到它的等電點(diǎn)而平衡 ， 蛋白質(zhì)樣品根據(jù)它自身的等電點(diǎn)分別向兩極移動，最后也達(dá)到平衡 。 ?等電聚焦 ? ?定氮法：靈敏度較低 ? ?雙羧脲法：樣品量 ? ?FolinLowry法：在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，將其與雙羧脲法結(jié)合起來，蛋白質(zhì)形成兩種顏色的混合物老綠色，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高 25?g250?g/ml. ??考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford法） 考馬斯亮藍(lán) G250是一種帶有負(fù)電荷的染料，在酸性條件下，可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍(lán)色化合物，在 595nm具有特定吸收，反應(yīng)簡便、快速、靈敏度高， 550 ?g/ml. ? ?紫外吸收法 ? 由于核酸在 260nm具有光吸收，對測定干擾較大，可采用 280nm、 260nm同測法。 ? 蛋白質(zhì)濃度 mg/ml＝ ? 純度和分子量的測定 ：采用電泳（如聚丙烯酰胺凝膠電泳，梯度凝膠電泳等）、高速離心、分子篩層析、高效液相色譜等技術(shù)測定。 ? 等電點(diǎn)的測定 ：利用等電聚焦方法測定。 ? 亞基個數(shù)的測定 ：采用 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳方法測定。
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