【正文】 224。n yǒnɡ),(三) 透析和超濾,(四) 層析,(五) 超速離心,第一百零八頁，共一百三十二頁。,分類： 根據(jù)支持物的不同，電泳(di224。n yǒnɡ)電泳(di224。n yǒnɡ)可分為： 薄膜電泳、凝膠電泳。,〔二〕電 泳,概念： 帶電顆粒在電場中向著所帶電荷相反(xiāngfǎn) 方向 移動稱為電泳。,原理： 不同的蛋白質(zhì)的因結(jié)構(gòu)、形狀和帶電 量的 不同而有不同的泳動速度(s249。d249。)，從而 到達(dá)分析和別離蛋白質(zhì)的目的。,應(yīng)用：電泳技術(shù)是生化常用分析技術(shù)之一,第一百零九頁，共一百三十二頁。,利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過(tōnggu242。)超濾膜(一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在膜上，稱為超過濾。,將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流動的適當(dāng)?shù)木彌_液〔如純水〕中，小分子雜質(zhì)(z225。zh236。)〔如硫酸銨、氧化鈉等〕從袋中透出，而蛋白質(zhì)保存于袋中從而將蛋白質(zhì)純化，這種方法稱為透析。,〔三〕透析,第一百一十頁，共一百三十二頁。,透析工作(gōngzu242。)圖,半透膜原理(yu225。nlǐ),第一百一十一頁，共一百三十二頁。,層析種類： 凝膠過濾(gu242。lǜ)〔分子篩〕 離子交換層析〔陰離子和陽離子〕 親和層析,(四) 層析(c233。nɡ xī),第一百一十二頁，共一百三十二頁。,帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合,帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱,陽離子交換(jiāohu224。n)樹脂工作示意圖,第一百一十三頁，共一百三十二頁。,分子篩層析(c233。nɡ xī),第一百一十四頁，共一百三十二頁。,〔五〕,第一百一十五頁，共一百三十二頁。,親和層析工作(gōngzu242。)示意圖,蛋白質(zhì),載體(z224。itǐ)介質(zhì),配體,結(jié)合(ji233。h233。),洗脫,洗脫介質(zhì),第一百一十六頁，共一百三十二頁。,(六) 超速離心,第一百一十七頁，共一百三十二頁。,三、多肽鏈中氨基酸的順序(sh249。nx249。)分析,第一步： 別離提純蛋白質(zhì) ，測定NH2末端的數(shù)目(sh249。m249。)，確定蛋白質(zhì)分子是 由幾條肽鏈構(gòu)成的，并別離出 每條肽鏈。測定肽鏈的分子量,計算組成該肽鏈的氨基酸殘基數(shù)。及每種aa的百分組成。,一般(yībān)過程：,肽鏈分子中氨基酸殘基數(shù)=肽鏈的分子量247。120 〔各種的氨基酸殘基的平均分子量為120〕,再將肽鏈徹底水解，用離子交換層析法將各種的氨基酸別離。,第一百一十八頁，共一百三十二頁。,a. 丹磺酰氯法 丹磺酰氯是一種強(qiáng)熒光劑，它能專一地與鏈N端α氨基反響生成丹磺酰肽，后者水解生成的丹磺酰氨基酸具有很強(qiáng)的熒光，可直接(zh237。jiē)用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N端是何種氨基酸。,第二步 測定(c232。d236。ng)肽鏈的氨基末端和羧基末端,1. N末端(m242。 duān)的測定,b. 二硝基苯氟法 ：過時，不用,第一百一十九頁，共一百三十二頁。,2. C末端(m242。 duān)的測定,常用(ch225。nɡ y242。nɡ)羧基肽酶法,羧基肽酶專一地將肽鏈水解成片斷(pi224。ndu224。n)，分別進(jìn)行順序分析。,第一百二十頁，共一百三十二頁。,第三步 肽鏈的局部(jb249。)水解,胰蛋白酶(y237。 d224。n b225。i m233。i)的作用原理,1. 酶解法(jiě fǎ),第一百二十一頁，共一百三十二頁。,CNBr與Met反響測定(c232。d236。ng)Pr的一級結(jié)構(gòu),2. 化學(xué)法,第一百二十二頁，共一百三十二頁。,層析鑒定就可N端開始(kāishǐ)確定被測肽段的氨基酸排列順序,第四步 肽段氨基酸順序(sh249。nx249。)分析,一般(yībān)采用 Edman降解法,弱堿條件,異硫氰酸苯酯,+,N端α氨基,苯氨基硫甲酰肽(PTC肽〕,酸性條件,環(huán)化,水解,苯乙內(nèi)酰硫氨基酸(PTHaa),失去原N端氨基酸的肽,剩下的肽可反復(fù)進(jìn)行上述處理，依次生成各種PTHaa，,第一百二十三頁，共一百三十二頁。,Edman降解(ji224。nɡ jiě)法的示意圖,第一百二十四頁，共一百三十二頁。,一般常用多種方法使肽鏈斷裂，并分析出各肽段中的氨基酸順序。由于在不同部位斷鏈，只要(zhǐy224。o)找出多套肽段的重疊部位，然后組合排列比照，即可推斷肽段的排列順序，從而得出完整肽鏈中氨基酸的順序。,第五步 肽鏈一級結(jié)構(gòu)(ji233。g242。u)確實定,第一百二十五頁，共一百三十二頁。,那么其氨基酸排列(p225。ili232。)順序為： ThrAsnValLysAlaTrpGlylys,如測一個(yī ɡ232。)九肽,測得N端氨基酸殘基為Thr,又分別(fēnbi233。)測得片斷: AlaAlaTrpGlyLys ValLysAlaAlaTrp ThrAsnValLys,另外，亦可以通過基因中核苷酸順序推測蛋白質(zhì)的氨基酸順序,第一百二十六頁，共一百三十二頁。,四、肽與蛋白質(zhì)的人工合成(r233。n ɡōnɡ h233。 ch233。nɡ),1.原料 aa 2. 保護(hù)劑 與NH2或COOH 反響(fǎny236。ng)，易去掉 3.縮合劑 4.COOH 、NH2活化劑,第一百二十七頁，共一百三十二頁。,合成(h233。ch233。ng)步驟,αNH2和αCOOH 的保護(hù)與活化(hu243。hu224。) 接肽反響 脫去保護(hù)劑,第一百二十八頁，共一百三十二頁。,四、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測定(c232。d236。ng),1. X射線晶體(jīngtǐ)衍射法,X衍射圖代表射線穿過〔蛋白質(zhì)〕晶體的一系列平行剖面(pōumi224。n)的各原子的電子密度，然后再借助計算機(jī)繪制出三維的電子密度圖。,2.二維磁共振技術(shù),3. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測,〔1〕根據(jù)分子力學(xué)、分子動力學(xué)、物理化學(xué)原理，從理論上計算推測蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),〔2〕從蛋白空間結(jié)構(gòu)規(guī)律，從一級結(jié)構(gòu)推測空間結(jié)構(gòu)。,第一百二十九頁，共一百三十二頁。,本章(běn zhānɡ)小節(jié),蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用：功能蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白 蛋白質(zhì)的組成〔元素組成、化學(xué)組成〕及蛋白質(zhì)含量的測定 二十種氨基酸的結(jié)構(gòu)、分類及名稱〔三字(sān z236。)縮寫符、單字縮寫符〕 氨基酸的重要理化性質(zhì)：兩性解離、茚三酮顯色、與異硫氰酸苯酯〔PITC〕的反響 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：肽、肽鍵、活性多肽及一級結(jié)構(gòu)的測定 蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)單元〔 ?螺旋、?折疊、 ?轉(zhuǎn)角、自由回轉(zhuǎn)〕、三級與四級結(jié)構(gòu)〔超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、亞基〕及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的性質(zhì)：大分子性質(zhì)、蛋白質(zhì)分子量的測定〔離心法、凝膠過濾法、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法〕、兩性解離〔等電點、電泳、離子交換〕、膠體性質(zhì)、蛋白質(zhì)沉淀〔可逆沉淀、不可逆沉淀〕、蛋白質(zhì)變性、紫外吸收及顏色反響 蛋白質(zhì)的分類：按外形及組成分類,第一百三十頁，共一百三十二頁。,問 題,為什麼說蛋白質(zhì)是生命活動最重要的物質(zhì)根底？ 試比較Gly、Pro與其它常見氨基酸結(jié)構(gòu)的異同，它們對多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的形成有何影響？ 試舉例說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(guān x236。)〔包括一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系(guān x236。)〕。 為什么說蛋白質(zhì)水溶液是一種穩(wěn)定的親水膠體？ 什麼是蛋白質(zhì)的變性？變性的機(jī)制是什麼？舉例說明蛋白質(zhì)變性在實踐中的應(yīng)用。 名詞解釋 等電點〔pI〕 肽鍵和肽鏈 肽平面及二面角 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域 蛋白質(zhì)變性與復(fù)性 肽,第一百三十一頁，共一百三十二頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),第一節(jié) 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成(zǔ ch233。nɡ)。——蛋白質(zhì)的根本構(gòu)成。氨基酸酸性解離和堿性解離的程度相等。單純蛋白質(zhì)——全部由aa組成(zǔ ch233。nɡ)。結(jié)合蛋白質(zhì)——除蛋白局部外。纖維蛋白質(zhì)——分子狀如纖維，其長軸。球狀蛋白質(zhì)——分子狀如球形或橢圓形。肽鍵中的Ｃ＝Ｏ和Ｃ－Ｎ均不能自由旋轉(zhuǎn)。常為兩條或兩條以上伸展的多肽鏈。一條肽鏈通過盤曲折疊,常形成2 個或多個在空間上可以明顯區(qū)分的折疊實體，稱為結(jié)構(gòu)域.。蛋白質(zhì)酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)的解離程度相當(dāng),第一百三十二頁，共一百三十二