【正文】 通過透析，小分子通透透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白質(zhì)不能通透透析袋，留在透析袋內(nèi)。從而，蛋白質(zhì)溶液中的小分子物質(zhì)通過透析被分離除去。 2. 超濾：利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，通過施加正壓使溶液中的分子量的物質(zhì)保留在膜的上面，而能通過濾膜的物質(zhì)被濾出。 超濾（ ultrafiltration） : 在一定的壓力下，使蛋白質(zhì)溶液在通過一定孔徑的 超濾膜時，小分子量物質(zhì)濾過，而大分子量的蛋白質(zhì)被 截留，從而達(dá)到分離純化的目的。這種方法既可以純化 蛋白質(zhì)，又可達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 磁力攪拌器 待超濾的蛋白質(zhì)溶液 加壓的氮氣 超濾膜 （二）有機(jī)溶劑、鹽析及免疫沉淀 1. 有機(jī)溶劑沉淀： 降低溶液的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子間相互吸引而沉淀。 2. 鹽析：向蛋白質(zhì)溶液中加入 中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象，稱為 鹽析。 中性鹽可破壞蛋白質(zhì)的水化膜并中和其電荷。 3. 免疫沉淀：利用某種蛋白質(zhì)的特異性抗體，與蛋白質(zhì)混合溶液中該種蛋白質(zhì)形成抗原 抗體復(fù)合物而達(dá)到分離的方法。 （三）電泳：帶電粒子（如蛋白質(zhì)）在電場中向著與其所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象，稱為電泳。 SDSPAGE可測定蛋白質(zhì)的分子量 （四）層析技術(shù)：根據(jù)待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)（如溶解度、吸附能力、分子形狀、所帶電荷、分子量等）的不同，利用其對固定相和流動相親和力的不同而達(dá)到分離的技術(shù)。 離子交換層析分離蛋白質(zhì)示意圖 用 高 濃 度 的陰 離 子 洗 脫— 帶 負(fù) 電 荷 少 的蛋 白 質(zhì) 先 洗 脫 下 來++++++++++———————————————+++++++++++——————用 低 濃 度 的陰 離 子 洗 脫++++++++++———————————————+++++++++++++++++++ +++++++++++++———————————————————————— 帶 負(fù) 電 荷 多 的蛋 白 質(zhì) 后 洗 脫 下 來陰 離 子 交 換 劑———————洗 脫 洗 脫 洗 脫樣 品凝 膠 顆 粒大 分 子 先 洗 脫 下 來 小 分 子 后 洗 脫 下 來 凝膠過濾分離蛋白質(zhì)示意圖 凝膠過濾法 可測定蛋白 質(zhì)的分子量 （五）離心技術(shù)：根據(jù)待分離物質(zhì)密度（如蛋白質(zhì)）的差別，在離心場力的作用下對其進(jìn)行分離純化的方法。可測定蛋白質(zhì)的分子量。 勻漿 沉淀 上清 1 000?g,5min 上清 上清 上清 上清 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 4 000?g,10min 15 000?g,20min 30 000?g,30min 100 000?g,90min 100 000?g,180min （未破壞的 真核細(xì)胞） （細(xì)胞膜碎 片，細(xì)胞核） （線粒體， 細(xì)菌） （溶酶體， 菌體碎片） （微粒體） （核糖核蛋白體） 胞液 亞細(xì)胞成分的差速離心分離 差速離心法是沉降速度離心的一種，采用離心力由小到大的分階段離心的辦法，將密度不同的物質(zhì)分步驟地逐一分離開來。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分離就是其中最好的例子。 差速離心法 三、多肽鏈中氨基酸序列分析 1. 測序前的準(zhǔn)備 ① N端分析以確定蛋白質(zhì)的多肽鏈數(shù)目 ② 斷裂二硫鍵 ③ 分離單一多肽鏈 ④ 測定多肽鏈的氨基酸組成 2. 多肽鏈氨基末端與羧基末端分析 ① 二硝基氟苯（ 1fluoro2,4dinitrobenzene）法 ② 丹酰氯 (dansyl chloride)法 3. 多肽鏈的氨基酸序列測定和重疊組合 ① 對多肽鏈進(jìn)行限制性水解成小片段 ② Edman降解法進(jìn)行小片段肽段的序列分析 ③ 對各片段序列進(jìn)行比較疊加，拼出完整的多肽序列 相對熒光值 0 4 8 12 谷 天冬 羧甲半胱 天胺 絲 谷胺 組 甘 蘇 精 丙 氨基丁酸 酪 蛋 纈 苯丙 異亮 亮 賴 氨基酸的高效液相色譜分析 分析多肽鏈的氨基酸組成 NS O2C lH3CH3C+C HH2NR1C O N H C HR2C O N H丹 酰 氯多 肽 鏈NS O2H3CH3CC HR1C O N H C HR2C O N HN H丹 酰 肽酸 水 解NS O2H3CH3CC HR1C O O HN H丹 酰 氨 基 酸 （ 強(qiáng) 熒 光 ）+多 種 游 離 氨 基 酸丹酰氯法檢測多肽鏈 N端示意圖 C HCNC HOHCC HNCR 39。 39。HNHCCO HOH2NROO R 39。 39。 39。HR 39。水 解 肽 鍵 的 位 置水 解 肽 鍵 的 酶 或 試 劑 對 被 水 解 肽 鍵 羧 基 側(cè) R 的 要 求胰 蛋 白 酶 精 、 賴胰 凝 乳 蛋 白 酶 芳 香 族 氨 基 酸 ： 苯 丙 、 酪 、 色金 黃 色 葡 萄 球 菌 內(nèi) 肽 酶 V 8 谷溴 化 氰 蛋亞 碘 酰 基 苯 甲 酸 色常用的多肽鏈水解方法及其作用點 多肽片段的層析與電泳雙向分離 原點 層析方向 電泳方向 不同長度和不同 帶電狀態(tài)的肽片段 多肽片段的分離 N H 2 N C H R 1 C N O H C H R 2 C N O H C H R 3 C N O H C H R 1 C N O H C H R 2 C N O H C H R 3 C N O H H N C S N H C N H C N C S O R 1 H H 2 N C H R 2 C N O H C H R 3 C N O H 多 肽 ( 氨 基 酸 = n ) 異 硫 氰 酸 苯 酯 苯 氨 基 硫 甲 酰 多 肽 苯 乙 內(nèi) 酰 硫 脲 衍 生 物 6 m o l / L H C l 多 肽 ( 氨 基 酸 = n 1 ) 重 復(fù) 下 一 輪 反 應(yīng) C S Edman降解法 熒 光 時間 氨基酸的組成分析： 2苯、 6丙、 3蛋、 4甘、 2精、 1賴、 3亮、 1酪、 2絲、 1蘇、 1天、 1纈、 1異、 1組 多肽鏈的 N端和 C端的確定： H甘，天 OH 多肽的水解和肽段的測序： 胰蛋白酶水解： 甘 丙 丙 蘇 蛋 組 酪 苯 精 甘 丙 絲 蛋 丙 亮 異 賴 苯 甘 亮 蛋 丙 纈 絲 精 亮 甘 丙 天 溴化氰水解： 甘 丙 丙 蘇 蛋 組 酪 苯 精 甘 丙 絲 蛋 丙 亮 異 賴 苯 甘 亮 蛋 丙 纈 絲 精 亮 甘 丙 天 多肽段的組合疊加： 甘 丙 丙 蘇 蛋 組 酪 苯 精 甘 丙 丙 蘇 蛋 組 酪 苯 精 甘 丙 絲 蛋 甘 丙 絲 蛋 丙 亮 異 賴 丙 亮 異 賴 苯 甘 亮 蛋 苯 甘 亮 蛋 丙 纈 絲 精 丙 纈 絲 精 亮 甘 丙 天 亮 甘 丙 天 H甘 丙 丙 蘇 蛋 組 酪 苯 精 甘 丙 絲 蛋 丙 亮 異 賴 苯 甘 亮 蛋 丙 纈 絲 精 亮 甘 丙 天 OH 兩種水解作用所得肽鏈的測序與組合 四、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測定 圓二色光譜技術(shù) X射線衍射技術(shù) 核磁共振技術(shù) 肌紅蛋白結(jié)晶的 X線衍射圖 John Kendrew對抹香鯨肌紅蛋白結(jié)晶進(jìn)行了 X線衍射分析，其衍射圖中包含了 25 000個衍射光點。衍射圖譜中光點的強(qiáng)度和光點的分布類型提供出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的足夠信息。根據(jù)這些衍射光點的密度與分布，通過計算機(jī)分析，繪出其三維電子密度分布圖，進(jìn)而得出空間結(jié)構(gòu)圖形。 X 線 源X 線 光 束蛋 白 質(zhì) 晶 體散 射 光 束 感 光 片肌紅蛋白結(jié)晶的衍射結(jié)果 （四）蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的確定 X線晶體分析 （ Xray crystallography） 核磁共振光譜分析 (nuclear magic resonance spectroscopy)