【正文】 Proteomics 蛋白質(zhì)組學(xué) Wilkins MR et al : proteome = PROTEin+genOME(蛋白質(zhì)組 ) ―一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)” Swinbanks : ―代表一完整生物的全套蛋白質(zhì)” Kahn P : ―反映不同細(xì)胞的不同蛋白質(zhì)組合” “蛋白質(zhì)組 proteome‖ 有不同的含義： ? 廣義上講， 一個(gè)基因組、一種生物或一種細(xì)胞 /組織所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)。 ? 狹義： 僅指特定的細(xì)胞或組織在特定的階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。 具有時(shí)空性，比基因組研究更復(fù)雜。 (1) Definition: 蛋白質(zhì)組學(xué)（ proteomics) 研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。 差異蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)、臨床蛋白質(zhì)組學(xué)、疾病蛋白質(zhì)組學(xué)等。 (2) 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺 (高效率 ,高通量 ) ? 雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì) ? 蛋白質(zhì)點(diǎn)的定位和切取 ? 蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜分析 (3) 研究的科學(xué)意義 生物學(xué)問題的提出 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備 蛋白樣品的 IEF和 PAGE電泳分離 圖像掃描和初步分析 感興趣蛋白點(diǎn)的切取 胰酶對蛋白質(zhì)的消化 質(zhì)譜的多肽指紋圖分析 質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對 蛋白質(zhì)的鑒定 其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證 蛋白質(zhì)組學(xué)流程圖 蛋白質(zhì)樣品的色譜分離 Key terms 模體 (Motif ) 結(jié)構(gòu)域 (Domain) 蛋白質(zhì)的變性 (Denaturation of protein) 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn) (pI) Thank You If you have any questions, please don’t hesitate to ask ! 粗提 沉淀 , 離心等 分離 電泳，層析等 純化 – 電泳，層析等 鑒定 HPLC, MS, NMR 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的分離、純化與結(jié)構(gòu)分析 （一）透析及超濾法 * 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 * 超濾法 應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 透析 (Dialysis) （二）有機(jī)溶劑沉淀、鹽析及免疫沉淀 * 有機(jī)溶劑：常用丙酮 、 乙醇等沉淀 ， 濃度不能太高 ，低溫 * 鹽析 (salt precipitation)是將高濃度中性鹽如硫酸銨 、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液 ， 使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞 ， 導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀 。 agarose bead ? 免疫沉淀法（ IP） 是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)的“ protein A/G‖能特異結(jié)合免疫球蛋白 FC片段的現(xiàn)象而發(fā)展的方法。目前多用精制的 protein A/G預(yù)先結(jié)合固化在 agarose beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后， beads上的 prorein A/G就能吸附抗原抗體達(dá)到沉淀抗原的目的。 protein A 抗原 抗體 （三）電泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng) 。 這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為 電泳 (elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 * SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE）， 常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 * 等電聚焦電泳 （ IEF）， 通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 * 雙向凝膠電泳 （ 2Dgel） 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。 Electrophoresis Estimating the molecular weight of a protein Marker （ SDSPAGE） Isoelectric focusing （ IEF） Twodimensional electrophoresis 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)之一 （四） 層析 (chromatography) 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 ? 離子交換層析 (ion exchange chromatography)：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。 ? 凝膠過濾層析 (gel filtration chromatography):又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 ? 此外還有親和層析 (Affinity chromatography), 疏水層析 (Hydrophobic interaction chromatography), 高效液相層析 (Highperformance liquid chromatography)等。 gel filtration chromatography Separates proteins by size Ionexchange chromatography Separates proteins by charge Separates proteins by their binding specificities Affinity chromatography （五）超速離心 * 超速離心法 (ultracentrifugation)既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量 。 * 蛋白質(zhì)在離心場中的行為用 沉 降 系 數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示 ,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān) 。 因?yàn)槌两迪禂?shù) S大體上和分子量成正比關(guān)系 ， 故可應(yīng)用超速離心法測定蛋白質(zhì)分子量 ， 但對分子形狀高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋白質(zhì)不適用 。 （六）多肽鏈中氨基酸序列分析 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基 把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用 Edman降解法 一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。 通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 分離編碼蛋白質(zhì)的基因 測定 DNA序列 排列出 mRNA序列 7. 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定 Spatial structure determination * 二級結(jié)構(gòu)測定 通常采用 圓二色光譜 (circular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量 。 ?螺旋的 CD峰有 222nm處的負(fù)峰 、 208nm處的負(fù)峰和 198 nm處的正峰三個(gè)成分；而 ?折疊的 CD譜不很固定 。 crystal preparation Xray diffraction , NMR * 三級結(jié)構(gòu)測定 X射線衍射法 (Xray diffraction)和核磁共振技術(shù) (nuclear magic resonance, NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法 。