【正文】 x (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.181 多維核磁共振波譜技術(shù)是目前唯一能夠用以測定蛋白質(zhì) （ 或核酸 ） 溶液三維結(jié)構(gòu) 的方法 。 自 1983 年瑞士蘇黎世高工 W252。thrich 教授實(shí)驗(yàn)室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素 （ glucagon） 多肽的溶液構(gòu)象 ，并在 1985 年運(yùn)用二維同核核磁共振方法確定了蛋白醉抑制劑 Ⅱ a 的溶液三維結(jié)構(gòu)以來 ， 至 2022 年 4 月PDB 庫中已有 2 293 個(gè)蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu) 。 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 13位因?qū)舜殴舱竦慕艹鲐暙I(xiàn)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)科學(xué)家 ? 1944年 ? 1952年 ? 1952年 ? 1955年 ? 1955年 ? 1964年 ? 1966年 ? 1977年 Vleck ? 1981年 ? 1983年 ? 1989年 ? 1991年 ? 2022年 W252。thrich 2022年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給對(duì)發(fā)展生物巨分子的鑒定與結(jié)構(gòu)分析之方法有重大貢獻(xiàn)的 John B. Fenn 、 田中耕一和 Kurt W252。thrich 。 前兩者發(fā)展出生物巨分子的質(zhì)譜分析 ， 后者發(fā)展出解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的NMR。 通常 ， 二維同核核磁共振方法已可以解析氨基酸殘基數(shù)在 100 以下的蛋白質(zhì)的溶液三維結(jié)構(gòu) 。 所謂 二維同核核磁共振實(shí)驗(yàn) ， 就是檢測組成蛋白質(zhì)的元素成分之一 ， 即 氫原子核 的二維核磁共振信號(hào) 。 所以 ， 二維同核核磁共振實(shí)驗(yàn)只要求穩(wěn)定的 、 可溶于水的自然豐度蛋白質(zhì)樣品 。 對(duì)于 ?類型的蛋白質(zhì) ， 或二級(jí)結(jié)構(gòu)單元主要是 ?折疊的蛋白質(zhì) ， 則運(yùn)用二維同核核磁共振方法可以確定分子量在一萬左右的此類蛋白質(zhì)的溶液結(jié)構(gòu) 。 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 對(duì)于分子量遠(yuǎn)高于 10 kDa 的蛋白質(zhì) ， 或二級(jí)結(jié)構(gòu)單元主要為 ?螺旋的多肽 ， 則需運(yùn)用多維 （ 三維 、 四維 ）異核核磁共振方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析 。 異核核磁共振方法除了要求蛋白質(zhì)可溶性和高穩(wěn)定性外 ， 蛋白質(zhì)分子必須要進(jìn)行 13C和 15N同位素富集 ， 也就是核磁共振樣品必須是 13C和 15N穩(wěn)定同位素雙標(biāo)記 的蛋白質(zhì) 。 多維異核核磁共振實(shí)驗(yàn)主要是檢測蛋白質(zhì)中 1H、 13C、 15N核之間的相關(guān)共振信號(hào) ， 用以提取確定蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本信息 。 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 多維核磁共振方法是通過各種類型的多維脈沖程序所執(zhí)行的核磁共振實(shí)驗(yàn) ， 間接提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 進(jìn)而用于計(jì)算機(jī)完成結(jié)構(gòu)運(yùn)算而獲得蛋白質(zhì)的溶液三維結(jié)構(gòu) 。 多維核磁共振方法已廣泛用于蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定 。 其基礎(chǔ)在于該方法是在組成蛋白質(zhì)的元素 ， 即碳 、 氫和氮原子水平上檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 。 這些原子的原子核猶如核磁共振波譜技術(shù)的探針 ，提供了各類原子在蛋白質(zhì)分子中所處的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息 ， 局域構(gòu)象信息以及微環(huán)境信息 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 所以 ， 對(duì)蛋白質(zhì)溶液樣品進(jìn)行各種類型的同核或異核核磁共振實(shí)驗(yàn) ， 處理并分析這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) ， 由核磁共振的波譜參數(shù)提取相應(yīng)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 建立用于蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算的數(shù)據(jù)文件 ， 最后運(yùn)用相應(yīng)的結(jié)構(gòu)計(jì)算軟件導(dǎo)出被測定的蛋白質(zhì)的溶液空間結(jié)構(gòu) ， 就是多維核磁共振方法確定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的 基本步驟 。 其中 ， 核磁共振的波譜信息可以正確反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息是確定蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 1 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 2 核磁共振的波譜信息 在組成蛋白質(zhì)分子的基本元素 H、 C、 N、 O中 ， 原子核自旋量子數(shù) I=1/2的核 1H、 13C、 15N是多維核磁共振檢測的主要對(duì)象 。 在外加靜磁場 （ 恒定超導(dǎo)磁場 ） H0的作用下 ， 這些核自旋量子數(shù)不為零的核能級(jí)發(fā)生分裂 。 如果同時(shí)將射頻磁場 H1作用到原子核系統(tǒng)上 ， 當(dāng)射頻場頻率 ?滿足關(guān)系式： ?=?H0， 原子核將吸收射頻場能量從低能級(jí)躍遷到高能級(jí) 。 這種共振躍遷現(xiàn)象就是 核磁共振現(xiàn)象 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 核磁共振波譜的譜峰包含有相當(dāng)豐富的與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息相關(guān)的波譜信息 ， 它們由波譜參數(shù)表示 。 直接用于確定蛋白質(zhì)分子溶液三維結(jié)構(gòu)的主要波譜參數(shù)為 NOE信號(hào)強(qiáng)度 、 J 耦合常數(shù) 。 此外 ， 化學(xué)位移 等參數(shù)也用于結(jié)構(gòu)的優(yōu)化 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 (1) NOE(核歐沃豪斯效應(yīng) )信號(hào)強(qiáng)度 NOE是偶極耦合核自旋之間交叉弛豫所引起的一種現(xiàn)象 ， 是原子核磁矩之間直接的偶極相互作用的結(jié)果 。 不同核之間的偶極 偶極弛豫 ， 分子內(nèi)部運(yùn)動(dòng)以及化學(xué)交換過程都可產(chǎn)生核自旋間的 交叉弛豫 。 交叉弛豫將導(dǎo)致核自旋之間的磁化強(qiáng)度轉(zhuǎn)移 ， 從而引起 NOE的發(fā)生 。 偶極耦合核自旋對(duì)之間的交叉弛豫不僅依賴于誘發(fā)弛豫的分子運(yùn)動(dòng)過程 ， 同時(shí)也與偶極耦合核自旋對(duì)之間的距離密切相關(guān) 。 NOE信號(hào)的強(qiáng)度可以提供蛋白質(zhì)中氫原子對(duì)之間的距離 ， 是蛋白質(zhì)分子溶液三維結(jié)構(gòu)計(jì)算中最重要的距離參數(shù) 。 此外 ， 蛋白質(zhì)分子中氫鍵的確定可以提供形成氫鍵的供體與受體原子之間的距離 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 (2) J 耦合常數(shù) 也稱為自旋 自旋耦合常數(shù) ， 它反映了原子核磁矩間通過圍繞在核外的電子云的間接傳遞作用而產(chǎn)生的能量藕合 。 核自旋 自旋耦合是兩個(gè)由化學(xué)鍵連接的原子核的磁矩通過核外圍電子間的磁相互作用而產(chǎn)生的標(biāo)量耦合 ， 分子內(nèi)部原子核的這種磁相互作用影響了原子核在核能級(jí)間的共振躍遷能量 （ 或共振頻率 ） ，使得核具有不同的躍遷能量 ， 導(dǎo)致核共振譜峰分裂為多重峰 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 多重峰譜線分量之間的距離表示核磁矩標(biāo)量耦合的強(qiáng)弱 ， 定義為 J耦合常數(shù) ， 單位為赫 （ Hz ） 。 J 耦合常數(shù)大小主要與連接兩個(gè)核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān) ， 與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分布的因素 ， 如單鍵或雙鍵 ，立體化學(xué)等與分子結(jié)構(gòu)有著密切關(guān)系的因素有關(guān) ， 而與外加磁場的大小無關(guān) 。 在蛋白質(zhì)分子中 ， 15N1H、13C1H、 13C13C等異核之間的單鍵 J 耦合常數(shù)都具有較大值 ， 這是異核多維核磁共振方法的基礎(chǔ) 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 (3)化學(xué)位移 在給定的射頻頻率下 ， 引起原子核共振躍遷的磁場強(qiáng)度 H 并不等于外加磁場 H0， 而是受核外電子云的屏蔽作用影響 。 核外電子在外加磁場的作用下 ， 可以產(chǎn)生感應(yīng)磁場 ， 對(duì)外加磁場起了一個(gè)屏蔽作用 。 如果是抗磁性屏蔽作用 ， 則原子核實(shí)際感受到的磁場將小于外加磁場 H0， 于是產(chǎn)生 核磁共振譜線的化學(xué)位移 。 化學(xué)位移的大小與外加磁場強(qiáng)度成正比 。 現(xiàn)在 ， 核磁共振波譜的化學(xué)位移用無量綱量 ?表示 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 對(duì)子蛋白質(zhì)分子而言 ， 同一類型的氨基酸殘基在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中的序列位臵不盡相同 ， 因而將位于不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元以及肽鏈三級(jí)折疊的不同空間位臵上。 氨基酸殘基的 lH、 13C和 15N核的化學(xué)位移將取決于核所處的具體結(jié)構(gòu)環(huán)境而擁有不同數(shù)值 。 所以 ， 蛋白質(zhì)分子的 1H、 13C和 15N共振譜線的化學(xué)位移反映了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及局域微環(huán)境結(jié)構(gòu)情況 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 3 由波譜參數(shù)提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 核磁共振波譜譜峰提供的波譜參數(shù)包含著如實(shí)反映分子結(jié)構(gòu)的豐富信息 。 由上述波譜參數(shù)提取的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息 ， 可用以正確地解析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元和三級(jí)空間折疊 。 由波譜參數(shù)需要提取蛋白質(zhì)的如下結(jié)構(gòu)信息 (1)反映結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)子對(duì)間距離 由 NOE信號(hào)強(qiáng)度可以導(dǎo)出蛋白質(zhì)的質(zhì)子對(duì)間的距離 ， 這是計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的最主要的實(shí)驗(yàn)依據(jù) 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 3 由波譜參數(shù)提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 按照產(chǎn)生 NOE 信號(hào)的兩個(gè)質(zhì)子之間相隔的氨基酸殘基數(shù)將 NOE 分類 ， 有相鄰氨基酸殘基間的 短程 NOE ；相隔 1~4 個(gè)氨基酸殘基間的 中程 NOE ；相隔 5 個(gè)以上氨基酸殘基間的 遠(yuǎn)程 NOE 。NOE 信號(hào)強(qiáng)度也相應(yīng)地分為 強(qiáng) NOE 、 中 NOE 和弱 NOE 。 由于蛋白質(zhì)分子的 ?螺旋 、 ?折疊片層以及轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu)具有顯著的不同結(jié)構(gòu)特征 ， 在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)單元中質(zhì)子對(duì)所給出的 NOE 信號(hào)強(qiáng)度也具有相應(yīng)的不同特征 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 3 由波譜參數(shù)提取蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 (2)反映主鏈和側(cè)鏈構(gòu)象的扭轉(zhuǎn)角 蛋白質(zhì)主鏈和側(cè)鏈上的核磁矩之間通過 3 個(gè)單鍵的 J 耦合常數(shù)是確定蛋白質(zhì)骨架和側(cè)鏈溶液構(gòu)象的最主要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 。 (3)反映主鏈規(guī)則排布的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元 多維核磁共振的化學(xué)位移參數(shù)可以直接提供蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息， 并已用于直接判斷構(gòu)成 ?螺旋及 ?折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)單元的氨基酸肽段 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 由核磁共振實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的流程示于圖 511中 。 首先 ， 將核磁共振波譜提供的 NOE 強(qiáng)度信息和 J 耦合常數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為用于結(jié)構(gòu)計(jì)算的 lH對(duì)之間的距離和二面角約束文件 ， 其中也包括形成氫鍵的受體與供體原子對(duì)之間的距離約束。 基于所輸入的蛋白質(zhì)氨基酸序列以及距離和二面角約束數(shù)據(jù)， 相應(yīng)的結(jié)構(gòu)計(jì)算軟件將構(gòu)建出蛋白質(zhì)分子的初始結(jié)構(gòu) ， 然后由分子動(dòng)力學(xué)進(jìn)行能量最小化計(jì)算 ， 由此得到一組收斂的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的空間坐標(biāo) 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) (1)建立核磁共振波譜數(shù)據(jù)的約束文件 在計(jì)算蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)時(shí) ， 由 NOE 信號(hào)強(qiáng)度導(dǎo)出的氫原子對(duì)之間的距離以及由 J 耦合常數(shù)導(dǎo)出的扭轉(zhuǎn)角不是簡單地直接輸入計(jì)算程序 ， 而是以距離或角度的上限 （ upper bound ） 和下限 （ lower bound ） 的格式輸入 。 這就構(gòu)成了距離約束文件和二面角約束文件 。 距離約束文件包含有兩方面 ， 一是由 NOE 提供的 NOE距離約束 ， 另一個(gè)是由氫鍵提供的距離約束 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) (1)建立核磁共振波譜數(shù)據(jù)的約束文件 通常 NOE 距離約束的下限取兩個(gè)質(zhì)子的范德華半徑之和 nm。 而距離約束的上限則需全面洞察 NOE信號(hào)強(qiáng)度的總體情況進(jìn)行分類 ， 一般可分成強(qiáng) 、 中 、 弱三類 NOE， 分別對(duì)應(yīng)距離~ nm、 ~ nm和 nm 。 對(duì)于一些分子量相對(duì)較大的蛋白質(zhì) ， 還可定義一類上限值更大 ， 如 nm 的很弱NOE 。 對(duì)上限值大于 nm 的 NOE 距離 ， 可將相應(yīng)的下限值定為 nm ， 這樣既可節(jié)省計(jì)算時(shí)間 ， 又可提高計(jì)算精度 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) (2)獲得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的一組構(gòu)象集合 目前已有多種計(jì)算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的程序 ， 可以歸納為三大類計(jì)算方法 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級(jí)結(jié)構(gòu)測定