【正文】 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 X 射線用底片是一個比較好的波松探頭 ， 是十幾年前用于記錄X 射線衍射的主要工具之一 ， 近年來由于面探測器和圖像板的使用 ， 底片已經(jīng)越來越少見 。 回擺相機(jī)（ 使用底片 ） 、 面探測器和圖像板等都是使用這種運(yùn)動方式來收集數(shù)據(jù)的 。 位相不能直接由實驗技術(shù)探測到 ， 因而只能通過一些間接的方法推導(dǎo)出來 。 視蛋白質(zhì)分子量的大小 ， 周期表中原子序數(shù)高于碘的元素及其化合物在引入晶體后都有可能提供位相信息 。 衍生物的最終鑒定還要依靠 帕特遜分析 ， 即找到重原子的位臵 ， 位臵找不對 ， 會得出完全錯誤的結(jié)果 。 所以在解酶與底物結(jié)合的絡(luò)合物結(jié)構(gòu)時 ， 應(yīng)首先考慮到在結(jié)晶狀態(tài)下形成絡(luò)合物的可能性 ， 不要失去這一機(jī)會 。 溴還有一個很重要的優(yōu)點 ， 它的吸收邊是在 nm ， 這個波長是同步輻射很容易調(diào)到的波長 ， 光通量也大 ，實在是非常理想的適用于所有晶體的衍生物 。 首先 ， 實驗的每一步都有誤差 ， 最后所有的誤差都會表現(xiàn)在電子密度上 ， 在解釋電子密度圖之前就有一些方法和原則改善電子密度圖 ， 稱為 電子密度圖的修飾 。 在這個基礎(chǔ)上可以對結(jié)構(gòu) （ 原子坐標(biāo) ） 進(jìn)行修正使其精化 。 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 13位因?qū)舜殴舱竦慕艹鲐暙I(xiàn)而獲得諾貝爾獎科學(xué)家 ? 1944年 ? 1952年 ? 1952年 ? 1955年 ? 1955年 ? 1964年 ? 1966年 ? 1977年 Vleck ? 1981年 ? 1983年 ? 1989年 ? 1991年 ? 2022年 W252。 其中 ， 核磁共振的波譜信息可以正確反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息是確定蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 多重峰譜線分量之間的距離表示核磁矩標(biāo)量耦合的強(qiáng)弱 ， 定義為 J耦合常數(shù) ， 單位為赫 （ Hz ） 。 由于蛋白質(zhì)分子的 ?螺旋 、 ?折疊片層以及轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)具有顯著的不同結(jié)構(gòu)特征 ， 在這些二級結(jié)構(gòu)單元中質(zhì)子對所給出的 NOE 信號強(qiáng)度也具有相應(yīng)的不同特征 。 對上限值大于 nm 的 NOE 距離 ， 可將相應(yīng)的下限值定為 nm ， 這樣既可節(jié)省計算時間 ， 又可提高計算精度 。 由上述波譜參數(shù)提取的蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息 ， 可用以正確地解析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元和三級空間折疊 。 NOE信號的強(qiáng)度可以提供蛋白質(zhì)中氫原子對之間的距離 ， 是蛋白質(zhì)分子溶液三維結(jié)構(gòu)計算中最重要的距離參數(shù) 。 多維核磁共振方法已廣泛用于蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)的確定 。 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 Hemoglobin 以核磁共振解析蛋白 質(zhì)構(gòu) 造 Bovine trypsin inhibitor 粗細(xì)線條 代表 蛋白 質(zhì) 骨架 的可能位置 核磁共振同 時 可以看出蛋白 質(zhì) 分子的振 動 情形 (并 非固定 ) Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.208 Nelson amp。 ■ 五 、 電子密度圖詮釋 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 一般來說 ， nm分辨率左右的圖大致可把握住分子邊界 ， 但有些蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)非常豐富 ， 如肌紅蛋白 ， 約含 70％ 的 ? 螺旋 ， 在這個分辨率下就可以跟蹤肽鏈走向了 。 雖然針對不同要求 ， 也可以選擇使用最佳數(shù)據(jù)處理方式 ， 以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù) ， 但顯然還不能完全滿足質(zhì)量評估的要求 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ② 硫 (S)原子 在很多蛋白質(zhì)中都存在 （ 胱氨酸 、 半胱氨酸 ） ， 硫原子的反常散射應(yīng)該充分利用 ， 最近有幾個蛋白質(zhì)已經(jīng)利用 S 原子的反常散射同時使用多波長反常散射法解析出了結(jié)構(gòu) 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 差值電子密度法 這是解決位相問題的最簡單方法 ， 但應(yīng)用范圍也最小 。 浸泡法是將蛋白質(zhì)晶體浸泡到含有重原子化合物的溶液中去 ， 溶液中的重原子化合物分子通過擴(kuò)散接近蛋白質(zhì)分子 ， 通過某種化學(xué)反應(yīng) （電價絡(luò)合 、 共價絡(luò)合 ） 或物理因素 （ 空間效應(yīng) ） 使重原子化合物固定在蛋白質(zhì)分子的某一部位 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ( l ） 制備重原子衍生物 使用同晶臵換法測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ， 原則上需要制備一個以上的同晶重原子衍全物， 同晶重原子衍生物越多 ， 越有可能消除位相雙解和實驗誤差 。 最后還要對晶體衍射質(zhì)量加以分析 ， 考慮數(shù)據(jù)收集方法等 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 面探測器 是由金屬絲構(gòu)成的面板 ， 同樣可以將 X 射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電信號 ， 因為它呈面板狀 ， 所以構(gòu)成了一組面探測器 ，可同時收集到多個衍射點 ， 相當(dāng)于一張底片 ， 從而使它 集計數(shù)管記錄數(shù)據(jù)精確和底片同時收集多點的效率兩者優(yōu)點于一身 ，是不久前實驗室內(nèi)經(jīng)常用于一般數(shù)據(jù)收集的儀器 。 再加上特殊的弧形晶體鏡面的垂直與水平聚焦 ， 射線的準(zhǔn)直性就更好了 。 蛋白質(zhì)晶體的密度與母液相當(dāng) ， 小心輕放可使其晶體浮于母液表面 ，小分子晶體則下沉 。 用這種方法可以使溶液體積小到幾微升 ， 這種簡單的方法雖然很有效 ， 但用來摸索晶休生長的條件時有一個 致命的弱點 ：很難改變晶體生長的化學(xué)條件 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 晶體生長的物理條件 這里所說的物理條件是指 溫度 、 震動 、 溶劑的清潔度、 試劑的純度 、 重力等因素 。 ② 要求在長晶體以前對其生物化學(xué)性質(zhì)盡量有一個非常透徹的了解 ， 樣品的分離提純條件往往就是晶體生長的最佳條件之一。 同時 ， 由于極強(qiáng)的同步輻射光源加上極細(xì)的聚焦 ，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)研究成為可能 ， 如大分子酶在晶體中的催化過程 。 使用 X 光膠片又引進(jìn)了一系列誤差。 不對稱單位是晶體結(jié)構(gòu)分析的單位 ， 它雖然是分子結(jié)構(gòu)的 獨立 單位 ，但它不是晶體的 重復(fù) 單位 ， 因為它不說明晶體的 周期性質(zhì) 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 周期函數(shù)和富里哀定理 周期函數(shù) 就是一個自身重復(fù)的函數(shù) 。 比如銅的 K?輻射 ， 是銅的 K 殼層電子躍遷到 L 層又返回 K 層后所發(fā)出的輻射 ， 其波長約為 nm ， 這是 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析經(jīng)常使用的 X 射線波長 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 生成 X 射線的另一種方式是同步加速器輻射 。 富里哀理論 表明， 任何一個有理的周期函數(shù)都可以通過把足夠數(shù)量的正 （ 余 ） 弦函數(shù)相疊加起來構(gòu)成原來的那個周期函數(shù)。 顯然 ， 只有晶胞才是晶體的最小單位 。 所以 X 射線衍射儀 、 轉(zhuǎn)靶 X 光機(jī) 、 細(xì)聚焦 X 光管 、多絲面探測器 、 圖像板 （ image plate ） 、 同步加速器輻射 …… 都應(yīng)運(yùn)而生了 。 目前 ， 時間的分辨已可達(dá)到納秒的水平 。 同時 ， 還要對樣品中的內(nèi)含物做到心中有數(shù) ， 特別是金屬離子 ， 需要了解清楚 。 在生物化學(xué)條件合適的情況下 ， 往往就可以得到微晶 ， 物理條件掌握得好 ，才可以獲得大的單晶 ， 因為物理條件控制了晶核形成的速度和晶體生長的速度 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最常用的方法當(dāng)屬 懸滴法 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 首先要充分了解到 ， 一套好的衍射數(shù)據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ) ， 衍射數(shù)據(jù)的好壞直接涉及結(jié)果的精度 。 陽極靶式 X 光機(jī)沒有這個優(yōu)點 。 無論四圓衍射儀還是多絲面探側(cè)器都可以在程序帶動下完成對一個未知晶體的空間群等初步晶體學(xué)參數(shù)的鑒定 ， 并隨后收集到它的全部衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù) ， 是 自動化很高的數(shù)據(jù)收集儀 。 這些步驟目前仍處于手工勞動階段 ， 大大影響了實驗進(jìn)度 ， 完全不符合批量生產(chǎn)結(jié)構(gòu)的要求 。 如果重原子有較強(qiáng)的反常散射 ， 一個重原子衍生物加上反常散射信息也可解決位相的雙解問題。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在制備重原子衍生物的過程中 ， 要不斷對衍生物進(jìn)行鑒定 ， 直到獲得滿意的重原子位臵為止 。 個別時候不同種屬的蛋白質(zhì)長出的晶體和已知結(jié)構(gòu)的該蛋白質(zhì)晶型一樣 （ 少有 ！ ) ， 更多的時候是在結(jié)晶狀態(tài)下 ， 該蛋白質(zhì)（ 酶 ） 和它的底物發(fā)生反應(yīng) ， 相對蛋白質(zhì)來說 ， 底物的大小是微不足道的 ， 或者免疫蛋白抗體和抗原決定簇 (小肽 )的結(jié)合 …… 這種不改變結(jié)晶狀態(tài)的情況下 ， 已知母體的結(jié)構(gòu) ， 若想求得酶和底物結(jié)合生成的絡(luò)合物結(jié)構(gòu) ， 使用差值電子密度法是最好不過了 。 ③ 一個很有發(fā)展前途的方法是使用 鹵族元素 在晶體低溫冷凍的過程中浸泡 ， 如溴或碘 ， 已經(jīng)有幾個結(jié)構(gòu)通過這種浸泡獲得了重原子衍生物 ， 再使用 MAD法解出了結(jié)構(gòu) 。 在求解位相這一步 ， 有個叫 SOLVE 的程序已經(jīng)可以用來全自動解位相。 對一般結(jié)構(gòu)來說 ， nm分辨率以上的圖才有可能分析出肽鏈走向 ， 特別是有一級結(jié)構(gòu)的信息 ， 這項工作容易進(jìn)行 ， 側(cè)鏈往往也能加上 。 Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.181 多維核磁共振波譜技術(shù)是目前唯一能夠用以測定蛋白質(zhì) （ 或核酸 ） 溶液三維結(jié)構(gòu) 的方法 。 其基礎(chǔ)在于該方法是在組成蛋白質(zhì)的元素 ， 即碳 、 氫和氮原子水平上檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 。 此外 ， 蛋白質(zhì)分子中氫鍵的確定可以提供形成氫鍵的供體與受體原子之間的距離 。 由波譜參數(shù)需要提取蛋白質(zhì)的如下結(jié)構(gòu)信息 (1)反映結(jié)構(gòu)特征的質(zhì)子對間距離 由 NOE信號強(qiáng)度可以導(dǎo)出蛋白質(zhì)的質(zhì)子對間的距離 ， 這是計算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的最主要的實驗依據(jù) 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 4 由核磁共振數(shù)據(jù)計算蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) (2)獲得蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的一組構(gòu)象集合 目前已有多種計算蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的程序 ， 可以歸納為三大類計算方法 。NOE 信號強(qiáng)度也相應(yīng)地分為 強(qiáng) NOE 、 中 NOE 和弱 NOE 。 核自旋 自旋耦合是兩個由化學(xué)鍵連接的原子核的磁矩通過核外圍電子間的磁相互作用而產(chǎn)生的標(biāo)量耦合 ， 分子內(nèi)部原子核的這種磁相互作用影響了原子核在核能級間的共振躍遷能量 （ 或共振頻率 ） ，使得核具有不同的躍遷能量 ， 導(dǎo)致核共振譜峰分裂為多重峰 。 ■ 一 、 概述 —— 蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)測定 第二節(jié) 核磁共振波譜的溶液結(jié)構(gòu)解析 所以 ， 對蛋白質(zhì)溶液樣品進(jìn)行各種類型的同核或異核核磁共振實驗 ， 處理并分析這些實驗數(shù)據(jù) ， 由核磁共振的波譜參數(shù)提取相應(yīng)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息 ， 建立用于蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu)計算的數(shù)據(jù)文件 ， 最后運(yùn)用相應(yīng)的結(jié)構(gòu)計算軟件導(dǎo)出被測定的蛋白質(zhì)的溶液空間結(jié)構(gòu) ， 就是多維核磁共振方法確定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的 基本步驟 。thrich 教授實驗室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素 （ glucagon） 多肽的溶液構(gòu)象 ，并在 1985 年運(yùn)用二維同核核磁共振方法確定了蛋白醉抑制劑 Ⅱ a 的溶液三維結(jié)構(gòu)以來 ， 至 2022 年 4 月PDB 庫中已有 2 293 個蛋白質(zhì)溶液三級結(jié)構(gòu) 。 nm 左右分辨率的圖往往可以正確解出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并給出原子模型 ， 并且可以分析晶體中有序水的結(jié)構(gòu) 。 電子密度圖是晶體結(jié)構(gòu)分析的直接結(jié)果 ，它包含了結(jié)構(gòu)的全部信急 ， 如何從一套電子密度圖分析出這些信息 ， 尚有一系列問題需要解決 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 雖然占有率不高 ， 但這一弱點恰恰被第三代同步加速器的高能量 、 細(xì)聚焦的優(yōu)點所彌補(bǔ) ， 收集高精度的反常散射數(shù)據(jù)可以使它提供位相信息