【正文】 結(jié)構(gòu) ， 也就談不上基因功能研究的現(xiàn)代化 。 這一步原屬于生物化學(xué)工作者的工作 ， 在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)時(shí)代 ， 很多實(shí)驗(yàn)室已把這一步工作作為 X 射線晶體學(xué)工作的第一步 。 以上的步驟也是結(jié)構(gòu)測(cè)定全自動(dòng)化分析的幾個(gè)基本環(huán)節(jié) 。 1 對(duì)原材料的要求 ① 晶體的重要特征是其內(nèi)部的高度有序性 ， 所以 要求能夠生長(zhǎng)晶體的原材料也應(yīng)具有高度的均一性 。 ② 要求在長(zhǎng)晶體以前對(duì)其生物化學(xué)性質(zhì)盡量有一個(gè)非常透徹的了解 ， 樣品的分離提純條件往往就是晶體生長(zhǎng)的最佳條件之一。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)是影響結(jié)構(gòu)分析速度的重要階段 。 還要注意到樣品在運(yùn)輸過程中的變化 ， 樣品一般應(yīng)以凍干粉保存 ， 否則就應(yīng)該處于液氮保存狀態(tài)之下 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2 晶體生長(zhǎng)的生物化學(xué)條件 小分子晶體生長(zhǎng)的自由能 、 相平衡理論 ， 溶質(zhì) 、 溶劑分散以及排斥和相互作用的學(xué)說等很難應(yīng)用于蛋白質(zhì)的晶體生長(zhǎng) ， 由于蛋白質(zhì)構(gòu)象固有的復(fù)雜性 ， 目前尚無法對(duì)溶液中的自由能 、 固態(tài)中可能形成的鍵數(shù)以及鍵能等因素進(jìn)行精確的理論計(jì)算和預(yù)測(cè) ， 所以 ， 蛋白質(zhì)的晶體生長(zhǎng)仍以經(jīng)驗(yàn)總結(jié)為主 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 首先要注意到 ， 生物化學(xué)的分離 、 提純過程就是蛋白質(zhì)不斷均一濃縮的過程 。 關(guān)鍵是要使這個(gè)過程足夠緩慢 ， 使蛋白質(zhì)有機(jī)會(huì)形成規(guī)則的周期排布 ， 才能形成大晶體 。 所以 ， 要了解蛋白質(zhì)分離 、 純化的條件 ， 注意蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 、 溶解度的信息 ， 注意純度 、 濃度和活力等有關(guān)信息 。 比如 ， 應(yīng)該了解離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)的影響 ，必要時(shí)做實(shí)驗(yàn)曲線了解 ? 鹽析 ? 或 ? 鹽溶 ? 的范圍 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 晶體生長(zhǎng)的物理?xiàng)l件 這里所說的物理?xiàng)l件是指 溫度 、 震動(dòng) 、 溶劑的清潔度、 試劑的純度 、 重力等因素 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 溫度是首先應(yīng)該注意到的問題 。 對(duì)不同蛋白質(zhì)選擇一個(gè)合適的溫度并將溫度保持恒定是晶體生長(zhǎng)的基本要求 。 反過來說 ， 基于同樣的理由 ， 有一種晶體生長(zhǎng)方法是專門利用溫度來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶解度的 ， 其先決條件是溫度必須是單向緩慢地變化 ， 即由高溫到低溫的緩慢變化 ， 使蛋白質(zhì)溶解度緩慢降低而達(dá)到過飽和 ， 這就是有名的 熱盒子法 。 震動(dòng)往往也會(huì)造成蛋白質(zhì)溶液的局部擾動(dòng) ， 加速晶核的形成 ， 所以晶體生長(zhǎng)需要防震 。 在 失重 情況下進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)已有很多實(shí)驗(yàn)報(bào)道 ， 沒有地心引力會(huì)使蛋白質(zhì)溶液更趨于均勻狀態(tài) ， 減少晶核的形成 ， 因此在外太空長(zhǎng)晶體成功的例子不少 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 技術(shù)和方法 X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析用的大晶體生長(zhǎng)的技術(shù)和方法也在不斷地發(fā)展之中 ， 整個(gè)的趨勢(shì)是 微量化和自動(dòng)化 ， 這主要是基于原材料少 、 難于分離提純的緣故 ， 晶體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)由毫升數(shù)量級(jí)降到微升數(shù)量級(jí)再降到納升數(shù)量級(jí) 。 將蛋白質(zhì)的過飽和溶液配好 ， 根據(jù)體積大小分裝在大小不同的試管中并密封， 然后臵于培養(yǎng)箱中控制各項(xiàng)物理因素 (溫度 、 防震 …… ） 。 用這種方法可以使溶液體積小到幾微升 ， 這種簡(jiǎn)單的方法雖然很有效 ， 但用來摸索晶休生長(zhǎng)的條件時(shí)有一個(gè) 致命的弱點(diǎn) ：很難改變晶體生長(zhǎng)的化學(xué)條件 。 將溶液分成兩部分 ， 含有蛋白質(zhì)的懸滴滴在蓋玻片上 ， 不含蛋白質(zhì)但含有某種鹽類的相同溶液放于貯液槽中 。 可想而知 ， 這個(gè)過程是緩慢的 ， 而且緩慢的程度還可以隨鹽濃度的改變而變化 。 同時(shí) ， 因?yàn)樗纳鲜鰞?yōu)點(diǎn) ， 也使它非常適合于晶體生長(zhǎng)的條件摸索實(shí)驗(yàn) 。 晶體已達(dá)到一定線度就可以進(jìn)行 X 射線衍射實(shí)驗(yàn) ， 蛋白質(zhì)分子量大 、 晶胞大 ， 所以衍射點(diǎn)密集 、 分辨率低 ， 而小分子正好相反 ， 并不難辨別 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)晶體 往往長(zhǎng)得沒有小分子晶體漂亮 ， 邊界常常不完整 ，很 容易形成多晶 。 如果溶液變干 ， 蛋白質(zhì)晶體由于脫水而變壞；小分子晶體則不變化 。 小分子晶體的偏光性強(qiáng)于蛋白質(zhì)晶體 ， 但使用偏光多用來鑒定晶體或其他非晶態(tài)物質(zhì) ， 如玻璃碎片 、 玻璃壁上的小氣泡 、 無定形沉淀等 。 蛋白質(zhì)晶體的密度與母液相當(dāng) ， 小心輕放可使其晶體浮于母液表面 ，小分子晶體則下沉 。 一套好的衍射數(shù)據(jù)又與晶體的好壞 、 X 射線源的強(qiáng)度以及收集數(shù)據(jù)的儀器和方法有關(guān) 。 數(shù)據(jù)收集有幾大環(huán)節(jié) ， 如晶體的收集 、 選擇 X射線源和選擇數(shù)據(jù)收集儀器等 。 水分子和蛋白質(zhì)中的解離基團(tuán)或酰胺基團(tuán)形成氫鍵 ， 構(gòu)成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個(gè)組成部分 ， 因而 ， 失水的晶體會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 。 這種毛細(xì)管專用于 X 射線衍射實(shí)驗(yàn) ， 玻璃的材料是特選的 ， 毛細(xì)管壁薄如紙 ， 為的是盡量減少對(duì) X 射線的吸收 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 現(xiàn)在使用 低溫冷凍晶體 的方法來收集數(shù)據(jù)已成常規(guī) ，蛋白質(zhì)晶體決速冷凍于液氮中 ， 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不受影響， 在收集數(shù)據(jù)的過程中 ， 使晶體處于液氮?dú)怏w的冷卻中 ， 由于低溫 ， 蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)降低 ， 從而提高了衍射分辨率 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2. X 射線源的選擇 無論是陽極靶式 （ 包括封閉管式和旋轉(zhuǎn)陽極靶式 ） ，還是同步加速器輻射 X 射線輻射光源 ， 都 要求 X 射線源的輻射流密度要盡量大 ， 即單位面積的光強(qiáng)大 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2. X 射線源的選擇 無論是哪種輻射源 ， 還 要求射線的發(fā)散度盡量小 ， 這又是同步加速器輻射的一大特點(diǎn) 。 再加上特殊的弧形晶體鏡面的垂直與水平聚焦 ， 射線的準(zhǔn)直性就更好了 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 按 記錄衍射線的方式 可將收集數(shù)據(jù)的裝臵分為兩大類， 一類是使用對(duì) X 射線敏感的照相底片或圖像板 （image plate ) ；另一類是計(jì)數(shù)管或面探測(cè)器 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 X 射線用底片是一個(gè)比較好的波松探頭 ， 是十幾年前用于記錄X 射線衍射的主要工具之一 ， 近年來由于面探測(cè)器和圖像板的使用 ， 底片已經(jīng)越來越少見 。 早期使用的外森堡相機(jī)和徘循相機(jī)是專門設(shè)計(jì)成使用 X 射線底片的相機(jī) 。 目前這兩種相機(jī)可能已進(jìn)入歷史博物館了 。 計(jì)數(shù)管多為正比計(jì)數(shù)管或閃爍計(jì)數(shù)管 ， 它將 X 射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電信號(hào) ， 信號(hào)放大后再轉(zhuǎn)換成數(shù)字存入計(jì)算機(jī)隨時(shí)調(diào)用 。 4 個(gè)圓配合 ， 可在某一特定時(shí)刻將某一衍射方向調(diào)到與小計(jì)數(shù)管接收方向一致 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 四圓衍射儀數(shù)據(jù)精確 ， 數(shù)據(jù)重復(fù)誤差只有 2 ％ 左右 ，但因?yàn)槭侵瘘c(diǎn)收集 ， 所以收集一套數(shù)據(jù)很費(fèi)時(shí) ， 這對(duì)大晶胞晶體收集數(shù)據(jù)時(shí)間之長(zhǎng)是難以忍受的 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 面探測(cè)器 是由金屬絲構(gòu)成的面板 ， 同樣可以將 X 射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電信號(hào) ， 因?yàn)樗拭姘鍫?， 所以構(gòu)成了一組面探測(cè)器 ，可同時(shí)收集到多個(gè)衍射點(diǎn) ， 相當(dāng)于一張底片 ， 從而使它 集計(jì)數(shù)管記錄數(shù)據(jù)精確和底片同時(shí)收集多點(diǎn)的效率兩者優(yōu)點(diǎn)于一身 ，是不久前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)常用于一般數(shù)據(jù)收集的儀器 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 近幾年開發(fā)出的 圖像板 又是在面探測(cè)器基礎(chǔ)上的一個(gè)改進(jìn) ， 增加了底片那種非常高的距離分辨的優(yōu)點(diǎn) ， 它是集底片和面探測(cè)器兩者優(yōu)點(diǎn)于一身的理想的收集數(shù)據(jù)的方法 ， 目前已被廣泛地應(yīng)用于 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析中 。 回?cái)[相機(jī)（ 使用底片 ） 、 面探測(cè)器和圖像板等都是使用這種運(yùn)動(dòng)方式來收集數(shù)據(jù)的 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 為了不使衍射斑點(diǎn)重疊 ， 必須使晶體每次僅回?cái)[一個(gè)很小范圍， 通常是 1176。 角 ， 依晶胞大小而定 。 利用部分反射點(diǎn)的信息可以計(jì)算出晶體方位與機(jī)械坐標(biāo)之間的偏離 （ misorientation ) ， 從而可以進(jìn)一步根據(jù)晶胞參數(shù)算出衍射線的排布 ， 進(jìn)而對(duì)衍射斑點(diǎn)進(jìn)行掃描并記錄它的強(qiáng)度 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化考慮 盡管像圖像板 、 衍射儀這樣的收集數(shù)據(jù)的裝臵自動(dòng)化程度已經(jīng)相當(dāng)高 ， 但為了滿足結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的要求 ， 衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化裝臵還有進(jìn)一步考慮的必要 。 晶體的收集 、 貯存 、 標(biāo)識(shí)和運(yùn)輸就是一個(gè)大問題 。 最后還要對(duì)晶體衍射質(zhì)量加以分析 ， 考慮數(shù)據(jù)收集方法等 。幸運(yùn)的是 ， 已經(jīng)有些實(shí)驗(yàn)室在摸索這方面的全自動(dòng)化問題 。 位相不能直接由實(shí)驗(yàn)技術(shù)探測(cè)到 ， 因而只能通過一些間接的方法推導(dǎo)出來 。 在已知結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上 ， 解決不同種屬不同來源的突變蛋白或它的復(fù)合物結(jié)構(gòu)還可以使用 分子臵換法和差值電子密度法 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶胞的大小和形狀 （ 包括對(duì)稱性 ） 決定了晶體的衍射方向；反過來 ， 通過衍射點(diǎn)的位臵可以推算出晶胞參數(shù)和空間群 ， 這叫做 初步晶體學(xué)參數(shù)的測(cè)定 。 在收集數(shù)據(jù)后 ， 還需對(duì)多套數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一 、 還原才可正式用于結(jié)構(gòu)分析 。 這些數(shù)據(jù)的強(qiáng)度需要校正極化因子和勞倫茲因子 （ LP 校正 ） 、 校正吸收因子 、 校正溫度因子 ， 最后再將所有數(shù)據(jù)統(tǒng)一在一個(gè)水平上 ， 才可進(jìn)行下一步的運(yùn)算 。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)晶體中引進(jìn)了適當(dāng)?shù)闹卦雍?， 就造成該晶體衍射線強(qiáng)度的差別 ， 從衍射強(qiáng)度的差別就有可能推出位相信息 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ( l ） 制備重原子衍生物 使用同晶臵換法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ， 原則上需要制備一個(gè)以上的同晶重原子衍全物， 同晶重原子衍生物越多 ， 越有可能消除位相雙解和實(shí)驗(yàn)誤差 。 最近發(fā)展起來的 多波長(zhǎng)反常散射 （ MAD ） 法 解晶體結(jié)構(gòu) ， 應(yīng)該看做是同晶臵換法的特例 。 視蛋白質(zhì)分子量的大小 ， 周期表中原子序數(shù)高于碘的元素及其化合物在引入晶體后都有可能提供位相信息 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)衍射強(qiáng)度的變化 ， 首先可以借助于帕特遜分析算出重原子的位臵 ， 從而獲得重原子的結(jié)構(gòu)振幅和位相的信息 ， 因?yàn)楦鶕?jù)實(shí)驗(yàn)可以直接測(cè)得重原子衍生物和母體的結(jié)構(gòu)振幅 （ 從強(qiáng)度 ）， 所以可以建立矢量三角形 （ 圓 ） 來推出母體的位相 。 與此同時(shí) ， 重原子必須在晶胞中占有一個(gè)或幾個(gè)固定的位臵 ， 而且和蛋白質(zhì)分子有相同的周期排列 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在蛋白質(zhì)中引進(jìn)所需要的重原子化合物一般有三種方法：蛋白質(zhì)經(jīng)化學(xué)修飾后再長(zhǎng)晶體 、 共晶生長(zhǎng)晶體和晶體浸泡法 。這種方法本來很費(fèi)時(shí)費(fèi)力 ， 已不多用 ， 但最近由于方法技術(shù)的改進(jìn)又死灰復(fù)燃 ， 用于多波長(zhǎng)散射中很有效 。 這種方法也不很有效 ， 已不多用 。 浸泡法是將蛋白質(zhì)晶體浸泡到含有重原子化合物的溶液中去 ， 溶液中的重原子化合物分子通過擴(kuò)散接近蛋白質(zhì)分子 ， 通過某種化學(xué)反應(yīng) （電價(jià)絡(luò)合 、 共價(jià)絡(luò)合 ） 或物理因素 （ 空間效應(yīng) ） 使重原子化合物固定在蛋白質(zhì)分子的某一部位 。 最初是肉眼觀察 ， 晶體發(fā)白或產(chǎn)生裂紋是晶體發(fā)生變化的信號(hào) 。 衍生物的最終鑒定還要依靠 帕特遜分析 ， 即找到重原子的位臵 ， 位臵找不對(duì) ， 會(huì)得出完全錯(cuò)誤的結(jié)果 。 帕特森分析對(duì)位臵少 、 占有率高的重原子可以給出較滿意的結(jié)果 ， 但對(duì)位臵多 、 占有率低的重原子則很難分析 。 母體位相可通過聯(lián)合概率法來計(jì)算 。 同一種蛋白但來源于不同種屬 ， 如人和動(dòng)物之間的同一種蛋白 ， 往往能滿足這一要求 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 分子臵換法的完成有兩個(gè)大步驟 ， 一是旋轉(zhuǎn) ， 一是平移 。 由于分子臵換法的計(jì)算技術(shù)不斷改進(jìn)和高精度衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)的使用 ， 現(xiàn)在 1~2 天解一個(gè)相似結(jié)構(gòu)的情況已很普通 ， 是 突變蛋白結(jié)構(gòu)解析的主要方法 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 差值電子密度法 這是解決位相問題的最簡(jiǎn)單方法 ， 但應(yīng)用范圍也最小 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 差值電子密度法 直接使用母體結(jié)構(gòu)的位相計(jì)算值作為位相 ， 使用結(jié)構(gòu)振幅 3F絡(luò)合物 － 2F母體 作為系數(shù)進(jìn)行富里哀加和 （