【正文】 ， 否則就應該處于液氮保存狀態(tài)之下 。 ② 要求在長晶體以前對其生物化學性質(zhì)盡量有一個非常透徹的了解 ， 樣品的分離提純條件往往就是晶體生長的最佳條件之一。 以上的步驟也是結(jié)構(gòu)測定全自動化分析的幾個基本環(huán)節(jié) 。 實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的全自動化分析 （ 其中不僅是 X射線晶體結(jié)構(gòu)的全自動化分析 ， 還包括 NMR的全自動化分析 ） ， 是結(jié)構(gòu)基因組學的基本要求 ， 否則很難想象實現(xiàn)工業(yè)化大批量 ? 生產(chǎn) ? 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) ， 也就談不上基因功能研究的現(xiàn)代化 。 顯然 ， 結(jié)構(gòu)生物學在研究基因功能的戰(zhàn)略任務上將起到關鍵性的作用 。 同時 ， 由于極強的同步輻射光源加上極細的聚焦 ，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的動態(tài)研究成為可能 ， 如大分子酶在晶體中的催化過程 。 比如 ， X光激光不斷向短波方向延伸 ， 就有可能發(fā)明 X光激光顯微鏡 ， 因為激光的位相已知 ， 將會使問題大大簡化 。 光學顯微鏡使人們能見到肉眼見不到的東西 ， 這是因為和光波波長相當?shù)臉颖揪嚯x （ 如細胞器等 ） 可以作為光波的衍射光柵 ， 衍射線經(jīng)物鏡的組合聚焦 （疊加 ） 給出了一個實體的虛像 ， 然后經(jīng)目鏡放大 ， 人們就可以見到細胞器了 。 早期 ， 人們樂觀地看到在馬脾上滴幾滴硫酸鎘溶液就可以獲得一種蛋白質(zhì)晶體 ， 待到方法突破之后 ， 人們才真正體會到蛋白質(zhì)晶體的生長原來是結(jié)構(gòu)分析的一個瓶頸 。 使用 X 光膠片又引進了一系列誤差。 當然 ， 這種化學修飾不能破壞晶體的周期排布性質(zhì) 。 第一個蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)是 肯德魯 （ Kendrew ） 于 1957 年完成的 肌紅蛋白 的 nm 分辨率結(jié)構(gòu) 。 (a)不對稱單位中有一個或多個分子； (b)分子由空間群對稱操作形成一組分子集合； (c)分子集合形成晶胞；(d)晶胞平移形成晶體 。 不對稱單位是晶體結(jié)構(gòu)分析的單位 ， 它雖然是分子結(jié)構(gòu)的 獨立 單位 ，但它不是晶體的 重復 單位 ， 因為它不說明晶體的 周期性質(zhì) 。 此外 ， 通過深入的研究又發(fā)現(xiàn) ， 晶體中結(jié)構(gòu)通過平移產(chǎn)生的重復部分又被劃分成 14種不同類型的 點陣 ， 這都是幾何晶體學的內(nèi)容 。 可以想象成晶體里面存在著無數(shù)個形狀 、 體積完全相同的小平行六面體 ， 這些平行六面體面靠面 ， 邊靠邊 ， 中間無縫隙 。 要想使用 X 射線衍射來測定某物質(zhì)的結(jié)構(gòu) ， 就必須將該物質(zhì)先制備成晶體 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 周期函數(shù)和富里哀定理 周期函數(shù) 就是一個自身重復的函數(shù) 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 著名的布拉格公式 (2dhklsinθ=nλ)就是根據(jù)散射線疊加的原理推導出來的 。 當光線打到光柵上時 ， 光柵上的每一個結(jié)點都變成了一個點光源 ， 它們向四面八方發(fā)射出與入射線有相同波長的散射線 ， 散射線在空間的疊加就會產(chǎn)生衍射現(xiàn)象 。 同步輻射因其輻射強度高 、 波長連續(xù)可變 、 準直性能好等特點而在許多科學領域內(nèi)獲得了廣泛的應用 ， 其中包括 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 。 比如銅的 K?輻射 ， 是銅的 K 殼層電子躍遷到 L 層又返回 K 層后所發(fā)出的輻射 ， 其波長約為 nm ， 這是 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析經(jīng)常使用的 X 射線波長 。 隨后 ，人們發(fā)現(xiàn)了 X 射線的波動本質(zhì) ， 其波長范圍大約在~10 nm 的范圍 。?第一節(jié) 蛋白質(zhì)溶液的熱力學 ?第二節(jié) 蛋白質(zhì)折疊動理學 ?第三節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊 一． 熱運動與蛋白質(zhì)構(gòu)象 二． 熱力學函數(shù)與熱力學平衡 三． 熱容量 四． van’t Hoff焓 五． 折疊 /退折疊轉(zhuǎn)變 六． 量熱法與折疊過程熱力學 第十講 蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析 ?第一節(jié) 蛋白質(zhì)溶液的熱力學 ?第二節(jié) 蛋白質(zhì)折疊動理學 ?第三節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊 一 、 折疊動理研究技術 二 、 兩態(tài)動理 三 、 過渡態(tài) 1. 折疊過程與過渡態(tài) 2. 對折疊過渡態(tài)的性質(zhì)分析 四 、 折疊中間態(tài) 1. 熔球態(tài) 2. 快態(tài)與慢態(tài) 3. 二硫鍵引起的中間態(tài) 4. 多結(jié)構(gòu)域蛋白的折疊 第十講 蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析 五 、 折疊的基本過程 1. 接觸形成 2. 螺旋 鏈環(huán)轉(zhuǎn)變 3. ?發(fā)卡形成 ?第一節(jié) 蛋白質(zhì)溶液的熱力學 ?第二節(jié) 蛋白質(zhì)折疊動理學 ?第三節(jié) 突變、穩(wěn)定性和折疊 二 、 突變與熱穩(wěn)定性 1. 疏水突變 2. 氫鍵突變 3. 適應極端條件的突變體 一 、 熱力學參數(shù)在分子水平上的解釋 1. 靜電相互作用 2. 范德華相互作用 3. 氫鍵 4. 疏水效應 5. 二硫鍵 第十講 蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)分析 三 、 突變與折疊過程 1. 過渡態(tài)的突變分析 2. 突變對穩(wěn)定性和折疊過程的影響 Nuclear Magic Resonance (NMR) Xray Crystallography CryoElectron Microscopy (cryoEM) 第十一講 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定 Nuclear Magic Resonance (NMR) Xray Crystallography CryoElectron Microscopy (cryoEM) Does not need crystals. More information about dynamics. Limit to MW 40,000. Less reliable. + + Atomic resolution. + Unlimited size. + Timeresolved study can be performed. + Techniques very robust. + Need crystals. Deal with very large plex. + Various sample forms can be studied. + Lower sample purity. + Does not need crystals. + Complicated experimental procedures. Lower resolution. 第十一講 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析是使用 X 射線作為物理工具 ， 以晶體作為研究對象 ， 晶體結(jié)構(gòu)作為研究結(jié)果的一種分析方法 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶體結(jié)構(gòu)分析所使用的 X 射線波長大多在 nm 左右 ， 與分子中原子的距離相當 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 生成 X 射線的另一種方式是同步加速器輻射 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ☆ 2 . X 射線衍射 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析所依賴的物理原理是 X 射線的衍射現(xiàn)象 ， 衍射現(xiàn)象的產(chǎn)生是 X 射線與組成晶體的原子核外電子相互作用的結(jié)果 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 條件是光柵的尺寸要和射線的波長是同數(shù)量級的 ， 這樣光柵上不同結(jié)點上的散射線才能發(fā)生相干 ， 即疊加。 它將入射線波長 、 衍射線方向以及光柵結(jié)構(gòu)三者建立起了數(shù)學的定量關系 ， 為 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎 。 富里哀理論 表明， 任何一個有理的周期函數(shù)都可以通過把足夠數(shù)量的正 （ 余 ） 弦函數(shù)相疊加起來構(gòu)成原來的那個周期函數(shù)。 晶體的最基本特征是它的內(nèi)部高度有序性 。 通常 ， 一個中等大小的單晶體 ， 邊長 2~3mm 的立方體內(nèi)含有 1020個左右這樣的平行六面體 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶體的另一個重要 性質(zhì) 就是 對稱性 。 顯然 ， 只有晶胞才是晶體的最小單位 。 5 天然和重組蛋白質(zhì) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的特殊性 早在 1830 年就有了血紅蛋白晶體 ， 而且直到 X射線晶體學問世 (1930年前后 )， 蛋白質(zhì)晶體已有很多 ， 但直到 1934 年 ， 英國著名晶體學家伯納爾 （ J. Bernal） 和克蘿芙特 （ D. Crowfoot, 就是 1956年解出維生素 B12晶體結(jié)構(gòu)的 霍奇金 教授 ， 她因此而獲得 1964 年諾貝爾獎 ） 才發(fā)現(xiàn) ， 研究蛋白質(zhì)晶體應該和小分子晶體完全不同 ， 后者往往是暴露在空氣中；而前者必須與母液一起密封在毛細管內(nèi) ， 以免蛋白質(zhì)晶體暴露在空氣中因失水而破壞 。 他們使用了相同的方法 ― 同晶臵換法 ，并因此而獲得了 1962 年的諾貝爾獎金 。 利用引進的重原子所造成的衍射線強度的差別 ， 使用帕特森函數(shù)就有可能推出位相信息 。 所以 X 射線衍射儀 、 轉(zhuǎn)靶 X 光機 、 細聚焦 X 光管 、多絲面探測器 、 圖像板 （ image plate ） 、 同步加速器輻射 …… 都應運而生了 。 用于小分子晶體生長的簡單蒸發(fā)過飽和法不適用于蛋白質(zhì)晶體的生長 。 這樣說來 ， X射線衍射晶體結(jié)構(gòu)分析和光學顯微鏡應該有大致類似的物理學原理 ， 所不同的是人們找不到一個透鏡來聚焦 X射線 ， 所以必須 通過富里哀加和來重現(xiàn)電子密度 。 在現(xiàn)階段 ， 由于儀器技術和方法的不斷改進 ， 以前測定一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)需要以年計算 ， 而現(xiàn)在可能只需要以天計算了 。 目前 ， 時間的分辨已可達到納秒的水平 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 反過來 ， 基因功能研究的需要 ， 又要求快速 、 準確 、 系統(tǒng)地測定每一個基因所表達的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) ， 目前人們也只是掌握了其中的 1％ ~2％ 而已 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì) X 射線晶體結(jié)構(gòu)測定的基本過程 ① 經(jīng)基因克隆 、 表達后所生成的蛋白質(zhì)提純 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長是影響結(jié)構(gòu)分析速度的重要階段 。 同時 ， 還要對樣品中的內(nèi)含物做到心中有數(shù) ， 特別是金屬離子 ， 需要了解清楚 。 使用樣品一般應在低溫狀態(tài)下操作 ， 若發(fā)現(xiàn)有純度問題就要小心鑒定 ， 最后很可能不得不使用高壓液相層析 （HPLC ） 來分析 ， 甚至分離 。 在純化的最后階段 ， 一旦溶液中的蛋白質(zhì)達到了溶解度最小的條件 , 同時蛋白質(zhì)溶液達到過飽和的時候 ， 蛋白質(zhì)在溶液中是處于亞穩(wěn)態(tài) ， 蛋白質(zhì)就能成核并形成晶體 ， 從溶液中析出 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在摸索晶體生長的過程中 ， 首先是緩沖液的選取 ， 其次是沉淀劑 ， 然后是蛋白質(zhì)濃度 ， 對有些蛋白質(zhì)來說 ， 還要考慮到使用特殊的金屬離子 、 防氧化劑 、 防腐劑 ， 甚至底物和輔酶等 ， 余下的就是經(jīng)驗了 。 在生物化學條件合適的情況下 ， 往往就可以得到微晶 ， 物理條件掌握得好 ，才可以獲得大的單晶 ， 因為物理條件控制了晶核形成的速度和晶體生長的速度 。 溫度的變化會造成蛋白質(zhì)溶液過飽和的擾動 ， 改變蛋白質(zhì)的溶解度 ， 這都是對大晶體生長非常不利的 。一般要在水泥臺上進行實驗 ， 同時不要因為性急而常常觀察 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最簡單的方法是 分批靜臵法 （ batch method ） 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最常用的方法當屬 懸滴法 。貯液槽中的溶液在實驗過程中可調(diào) ， 懸滴的量又可以很小 ， 這些都是這個方法的優(yōu)點 ， 所以該方法是晶體生長的最常用方法。 以下提到的一些方法對鑒別蛋白質(zhì)微晶或許會有幫助 。 用濕濾紙觸碰 ， 蛋白質(zhì)粉末會很決溶解；而小分子晶體則溶解很慢 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 首先要充分了解到 ， 一套好的衍射數(shù)據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)分析的基礎 ， 衍射數(shù)據(jù)的好壞直接涉及結(jié)果的精度 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1 晶體的收集和處理 蛋白質(zhì)晶體暴露于空氣中將解體 ， 這是因為蛋白質(zhì)晶體中含水量相當高 （ 20％ ~70% ） 。 蛋白質(zhì)晶體的收集有一整套手工操作的程序 ， 需要經(jīng)過一定的訓練方可掌握 。 對同一晶體來說 ， 只要蛋白質(zhì)對輻射有一定的耐受力 （否則在收數(shù)據(jù)的實驗過程中需要更換晶體 ） , X 射線源的強度越高 ， 晶體的衍射線強度也就越大 ， 衍射線強度越大