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正文內(nèi)容

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測(cè)定ppt課件(編輯修改稿)

2025-06-08 02:59 本頁(yè)面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 現(xiàn)在使用 低溫冷凍晶體 的方法來(lái)收集數(shù)據(jù)已成常規(guī) ,蛋白質(zhì)晶體決速冷凍于液氮中 , 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不受影響, 在收集數(shù)據(jù)的過(guò)程中 , 使晶體處于液氮?dú)怏w的冷卻中 , 由于低溫 , 蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)降低 , 從而提高了衍射分辨率 。 收集低溫冷凍的晶體不使用毛細(xì)管而是使用特殊的小圓環(huán) , 將晶體連同母液用這個(gè)小圓環(huán)取出來(lái) , 然后迅速臵于液氮中冷凍 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2. X 射線源的選擇 無(wú)論是陽(yáng)極靶式 ( 包括封閉管式和旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極靶式 ) ,還是同步加速器輻射 X 射線輻射光源 , 都 要求 X 射線源的輻射流密度要盡量大 , 即單位面積的光強(qiáng)大 。 對(duì)同一晶體來(lái)說(shuō) , 只要蛋白質(zhì)對(duì)輻射有一定的耐受力 (否則在收數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要更換晶體 ) , X 射線源的強(qiáng)度越高 , 晶體的衍射線強(qiáng)度也就越大 , 衍射線強(qiáng)度越大 , 數(shù)據(jù)誤差就越小 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2. X 射線源的選擇 無(wú)論是哪種輻射源 , 還 要求射線的發(fā)散度盡量小 , 這又是同步加速器輻射的一大特點(diǎn) 。 它的輻射功率集中于電子軌道平面附近在沿電子前進(jìn)方向兩側(cè)半張角的一毫弧內(nèi) , 這個(gè)范圍內(nèi)集中了輻射功率的 85%, 因此, 它可以在幾十米外得到高通量的光源 。 再加上特殊的弧形晶體鏡面的垂直與水平聚焦 , 射線的準(zhǔn)直性就更好了 。 陽(yáng)極靶式 X 光機(jī)沒(méi)有這個(gè)優(yōu)點(diǎn) 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 按 記錄衍射線的方式 可將收集數(shù)據(jù)的裝臵分為兩大類, 一類是使用對(duì) X 射線敏感的照相底片或圖像板 (image plate ) ;另一類是計(jì)數(shù)管或面探測(cè)器 。 按 記錄裝臵的運(yùn)動(dòng)方式 分 , 又有外森堡相機(jī) 、 徘循相機(jī) 、 回?cái)[相機(jī) 、 四圓衍射儀等之分 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 X 射線用底片是一個(gè)比較好的波松探頭 , 是十幾年前用于記錄X 射線衍射的主要工具之一 , 近年來(lái)由于面探測(cè)器和圖像板的使用 , 底片已經(jīng)越來(lái)越少見(jiàn) 。 這是 20 世紀(jì) 80 年代以前主要用來(lái)收集蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的方法 。 早期使用的外森堡相機(jī)和徘循相機(jī)是專門設(shè)計(jì)成使用 X 射線底片的相機(jī) 。 這兩種相機(jī)都要使用層線屏將外層衍射線擋住 , 只收取一層內(nèi)的衍射數(shù)據(jù) , 所以效率低 。 目前這兩種相機(jī)可能已進(jìn)入歷史博物館了 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 使用計(jì)數(shù)管記錄衍射線強(qiáng)度的裝臵主要是四圓衍射儀 。 計(jì)數(shù)管多為正比計(jì)數(shù)管或閃爍計(jì)數(shù)管 , 它將 X 射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電信號(hào) , 信號(hào)放大后再轉(zhuǎn)換成數(shù)字存入計(jì)算機(jī)隨時(shí)調(diào)用 。 四圓中的 3 個(gè)圓是調(diào)節(jié)晶體方位的 , 另一個(gè)圓在水平平面上調(diào)節(jié)計(jì)數(shù)管方位 。 4 個(gè)圓配合 , 可在某一特定時(shí)刻將某一衍射方向調(diào)到與小計(jì)數(shù)管接收方向一致 。 因此 , 四圓衍射儀是采用逐點(diǎn)收集數(shù)據(jù)方式的全自動(dòng)衍射數(shù)據(jù)收集儀器 , 它的優(yōu)缺點(diǎn)正好和底片相反 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 四圓衍射儀數(shù)據(jù)精確 , 數(shù)據(jù)重復(fù)誤差只有 2 % 左右 ,但因?yàn)槭侵瘘c(diǎn)收集 , 所以收集一套數(shù)據(jù)很費(fèi)時(shí) , 這對(duì)大晶胞晶體收集數(shù)據(jù)時(shí)間之長(zhǎng)是難以忍受的 。 同時(shí) ,晶體耐受輻射的時(shí)間有限 , 為了收集一套完整的數(shù)據(jù)就需要多次更換晶體 , 從而引入誤差降低數(shù)據(jù)的精度。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 面探測(cè)器 是由金屬絲構(gòu)成的面板 , 同樣可以將 X 射線光子強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電信號(hào) , 因?yàn)樗拭姘鍫?, 所以構(gòu)成了一組面探測(cè)器 ,可同時(shí)收集到多個(gè)衍射點(diǎn) , 相當(dāng)于一張底片 , 從而使它 集計(jì)數(shù)管記錄數(shù)據(jù)精確和底片同時(shí)收集多點(diǎn)的效率兩者優(yōu)點(diǎn)于一身 ,是不久前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)常用于一般數(shù)據(jù)收集的儀器 。 無(wú)論四圓衍射儀還是多絲面探側(cè)器都可以在程序帶動(dòng)下完成對(duì)一個(gè)未知晶體的空間群等初步晶體學(xué)參數(shù)的鑒定 , 并隨后收集到它的全部衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù) , 是 自動(dòng)化很高的數(shù)據(jù)收集儀 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 近幾年開發(fā)出的 圖像板 又是在面探測(cè)器基礎(chǔ)上的一個(gè)改進(jìn) , 增加了底片那種非常高的距離分辨的優(yōu)點(diǎn) , 它是集底片和面探測(cè)器兩者優(yōu)點(diǎn)于一身的理想的收集數(shù)據(jù)的方法 , 目前已被廣泛地應(yīng)用于 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析中 。 記錄裝臵的運(yùn)動(dòng)方式中最重要的一種方式為 回?cái)[法 。 回?cái)[相機(jī)( 使用底片 ) 、 面探測(cè)器和圖像板等都是使用這種運(yùn)動(dòng)方式來(lái)收集數(shù)據(jù)的 。 回?cái)[法又稱無(wú)層線屏周轉(zhuǎn)法 , 其特點(diǎn)是同時(shí)收集衍射空間的三維數(shù)據(jù) 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 為了不使衍射斑點(diǎn)重疊 , 必須使晶體每次僅回?cái)[一個(gè)很小范圍, 通常是 1176。 ~3176。 角 , 依晶胞大小而定 。 為了給衍射方向指標(biāo)化 , 使用了部分反射點(diǎn)的信息 , 即一個(gè)衍射斑點(diǎn)被分成兩半 ,分別落在相鄰的兩個(gè)圖像的相應(yīng)位臵上 。 利用部分反射點(diǎn)的信息可以計(jì)算出晶體方位與機(jī)械坐標(biāo)之間的偏離 ( misorientation ) , 從而可以進(jìn)一步根據(jù)晶胞參數(shù)算出衍射線的排布 , 進(jìn)而對(duì)衍射斑點(diǎn)進(jìn)行掃描并記錄它的強(qiáng)度 。 回?cái)[運(yùn)動(dòng)實(shí)際上是晶體在測(cè)角頭上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)的運(yùn)動(dòng) , 探測(cè)器面板垂于入射線在晶體的后方 , 與晶體的距離可調(diào) 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化考慮 盡管像圖像板 、 衍射儀這樣的收集數(shù)據(jù)的裝臵自動(dòng)化程度已經(jīng)相當(dāng)高 , 但為了滿足結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的要求 , 衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化裝臵還有進(jìn)一步考慮的必要 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 衍射數(shù)據(jù)收集的全自動(dòng)化考慮 用于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的晶體量很大 , 它們無(wú)一例外地要送到同步加速器輻射實(shí)驗(yàn)室去 。 晶體的收集 、 貯存 、 標(biāo)識(shí)和運(yùn)輸就是一個(gè)大問(wèn)題 。 晶體到達(dá)同步輻射實(shí)驗(yàn)室 , 又需要將晶體安裝到測(cè)角頭上并調(diào)試到衍射儀上 。 最后還要對(duì)晶體衍射質(zhì)量加以分析 , 考慮數(shù)據(jù)收集方法等 。 這些步驟目前仍處于手工勞動(dòng)階段 , 大大影響了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度 , 完全不符合批量生產(chǎn)結(jié)構(gòu)的要求 。幸運(yùn)的是 , 已經(jīng)有些實(shí)驗(yàn)室在摸索這方面的全自動(dòng)化問(wèn)題 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的核心問(wèn)題是位相問(wèn)題 。 位相不能直接由實(shí)驗(yàn)技術(shù)探測(cè)到 , 因而只能通過(guò)一些間接的方法推導(dǎo)出來(lái) 。 最基本的方法 , 也是用于一個(gè)未知結(jié)構(gòu)的最有效方法是 同晶臵換法 。 在已知結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上 , 解決不同種屬不同來(lái)源的突變蛋白或它的復(fù)合物結(jié)構(gòu)還可以使用 分子臵換法和差值電子密度法 。由于同步加速器輻射光源的改進(jìn) , 目前多波長(zhǎng)的 反常散射法 (MAD ) 已趨成熟 , 大有取代同晶臵換法的可能 , 使解決位相問(wèn)題大大簡(jiǎn)化 , 這對(duì)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究至關(guān)重要 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶胞的大小和形狀 ( 包括對(duì)稱性 ) 決定了晶體的衍射方向;反過(guò)來(lái) , 通過(guò)衍射點(diǎn)的位臵可以推算出晶胞參數(shù)和空間群 , 這叫做 初步晶體學(xué)參數(shù)的測(cè)定 。 但晶胞中的原子種類以及它在晶胞中的分布位臵決定了衍射線強(qiáng)度;反過(guò)來(lái) , 通過(guò)衍射線強(qiáng)度和一些方法 , 可以了解位相信息 , 從而通過(guò)富里衰加和獲得電子密度函數(shù) , 從而獲得原子在晶胞中的分布位臵 , 這就是 晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定的目的和結(jié)果 。 在收集數(shù)據(jù)后 , 還需對(duì)多套數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一 、 還原才可正式用于結(jié)構(gòu)分析 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1 數(shù)據(jù)的統(tǒng)一和還原 為了解出一個(gè)晶體結(jié)構(gòu) , 往往需要使用許多晶體收集到該蛋白質(zhì)的多套數(shù)據(jù) , 其中包括母體數(shù)據(jù)以及一個(gè)以上的重原子衍生物的數(shù)據(jù) 。 這些數(shù)據(jù)的強(qiáng)度需要校正極化因子和勞倫茲因子 ( LP 校正 ) 、 校正吸收因子 、 校正溫度因子 , 最后再將所有數(shù)據(jù)統(tǒng)一在一個(gè)水平上 , 才可進(jìn)行下一步的運(yùn)算 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 2 同晶臵換法 同晶臵換法 是由 Peruz于 20 世紀(jì) 50 年代發(fā)現(xiàn)的可以用于解決位相信息的方法 。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)晶體中引進(jìn)了適當(dāng)?shù)闹卦雍?, 就造成該晶體衍射線強(qiáng)度的差別 , 從衍射強(qiáng)度的差別就有可能推出位相信息 。 下面按順序介紹重原子衍生物的制備 、 帕特遜分析 、 同晶臵換法的基本原理 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ( l ) 制備重原子衍生物 使用同晶臵換法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) , 原則上需要制備一個(gè)以上的同晶重原子衍全物, 同晶重原子衍生物越多 , 越有可能消除位相雙解和實(shí)驗(yàn)誤差 。 如果重原子有較強(qiáng)的反常散射 , 一個(gè)重原子衍生物加上反常散射信息也可解決位相的雙解問(wèn)題。 最近發(fā)展起來(lái)的 多波長(zhǎng)反常散射 ( MAD ) 法 解晶體結(jié)構(gòu) , 應(yīng)該看做是同晶臵換法的特例 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 所謂 重原子衍生物 是指在蛋白質(zhì)晶體中通過(guò)某種方式引入原子序數(shù)遠(yuǎn)大于碳 、 氮 、 氧的重原子而構(gòu)成的晶體 。 視蛋白質(zhì)分子量的大小 , 周期表中原子序數(shù)高于碘的元素及其化合物在引入晶體后都有可能提供位相信息 。 這些重原子對(duì) X 射線的散射強(qiáng) , 有可能改變由碳 、 氮 、 氧組成的蛋白質(zhì)晶體的 X 射線衍射斑點(diǎn)的強(qiáng)度 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)衍射強(qiáng)度的變化 , 首先可以借助于帕特遜分析算出重原子的位臵 , 從而獲得重原子的結(jié)構(gòu)振幅和位相的信息 , 因?yàn)楦鶕?jù)實(shí)驗(yàn)可以直接測(cè)得重原子衍生物和母體的結(jié)構(gòu)振幅 ( 從強(qiáng)度 ), 所以可以建立矢量三角形 ( 圓 ) 來(lái)推出母體的位相 。 所引進(jìn)的重原子必須對(duì)晶體沒(méi)有大的破壞 , 即不改變?cè)瓉?lái)晶體中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和周期排列 。 與此同時(shí) , 重原子必須在晶胞中占有一個(gè)或幾個(gè)固定的位臵 , 而且和蛋白質(zhì)分子有相同的周期排列 。 這種不改變蛋白質(zhì)周期排布而又在固定位臵引入重原子的方法就叫做 ? 同晶臵換 ? , 這種晶體又稱為同晶臵換重原子衍生物 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在蛋白質(zhì)中引進(jìn)所需要的重原子化合物一般有三種方法:蛋白質(zhì)經(jīng)化學(xué)修飾后再長(zhǎng)晶體 、 共晶生長(zhǎng)晶體和晶體浸泡法 。 ① 通過(guò)一些化學(xué)反應(yīng)使蛋白質(zhì)某個(gè)基團(tuán)與重原子化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng) , 使它們之間形成共價(jià)鍵的連接 , 然后進(jìn)行晶體生長(zhǎng) 。這種方法本來(lái)很費(fèi)時(shí)費(fèi)力 , 已不多用 , 但最近由于方法技術(shù)的改進(jìn)又死灰復(fù)燃 , 用于多波長(zhǎng)散射中很有效 。 ② 將重原子化合物與蛋白質(zhì)在溶液中混合在一起生長(zhǎng)晶體 , 稱為共晶生長(zhǎng) 。 這種方法也不很有效 , 已不多用 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ③ 簡(jiǎn)單而又實(shí)用的方法就是 浸泡法 , 特別是有了一定經(jīng)驗(yàn)之后, 花一段時(shí)間 , 總可以找到一些合用的衍生物 。 浸泡法是將蛋白質(zhì)晶體浸泡到含有重原子化合物的溶液中去 , 溶液中的重原子化合物分子通過(guò)擴(kuò)散接近蛋白質(zhì)分子 , 通過(guò)某種化學(xué)反應(yīng) (電價(jià)絡(luò)合 、 共價(jià)絡(luò)合 ) 或物理因素 ( 空間效應(yīng) ) 使重原子化合物固定在蛋白質(zhì)分子的某一部位 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在制備重原子衍生物的過(guò)程中 , 要不斷對(duì)衍生物進(jìn)行鑒定 , 直到獲得滿意的重原子位臵為止 。 最初是肉眼觀察 , 晶體發(fā)白或產(chǎn)生裂紋是晶體發(fā)生變化的信號(hào) 。 最根本的鑒定還是通過(guò) X射線衍射實(shí)驗(yàn) ,觀察衍射斑點(diǎn)的情況 。 衍生物的最終鑒定還要依靠 帕特遜分析 , 即找到重原子的位臵 , 位臵找不對(duì) , 會(huì)得出完全錯(cuò)誤的結(jié)果 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 (2)重原子位臵確定 —— 帕特森 ( Patterson) 分析 這是一個(gè)以帕特森名字命名的函數(shù) , 在數(shù)學(xué)上稱為卷積 , 用它來(lái)計(jì)算原子間的矢量 。 帕特森分析對(duì)位臵少 、 占有率高的重原子可以給出較滿意的結(jié)果 , 但對(duì)位臵多 、 占有率低的重原子則很難分析 。 如果已經(jīng)獲得了一個(gè)較好的重原子衍生物 , 用它的同晶加上反常散射信息就可計(jì)算出一套母體位相 , 然后使用母體位相 , 較差的重原子衍生物與母體的結(jié)構(gòu)振幅之差為系數(shù)進(jìn)行富里哀加和, 這種圖上可以直接顯示重原子位臵 , 應(yīng)該比帕特森分析簡(jiǎn)單而且更靈敏 。 母體位相可通過(guò)聯(lián)合概率法來(lái)計(jì)算 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 3 分子臵換法 如果一個(gè)蛋白質(zhì)分子與另一個(gè)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子近似 , 這種近似粗略地可以從一級(jí)結(jié)構(gòu) ( 蛋白質(zhì)的氨基酸順序 ) 加以判斷 , 比如說(shuō)至少有 50% 的近似性 , 就可
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