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蛋白質的結構測定ppt課件(編輯修改稿)

2025-06-08 02:59 本頁面
 

【文章內容簡介】 X 射線晶體結構分析 現在使用 低溫冷凍晶體 的方法來收集數據已成常規(guī) ,蛋白質晶體決速冷凍于液氮中 , 蛋白質結構不受影響, 在收集數據的過程中 , 使晶體處于液氮氣體的冷卻中 , 由于低溫 , 蛋白質分子的熱運動降低 , 從而提高了衍射分辨率 。 收集低溫冷凍的晶體不使用毛細管而是使用特殊的小圓環(huán) , 將晶體連同母液用這個小圓環(huán)取出來 , 然后迅速臵于液氮中冷凍 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 2. X 射線源的選擇 無論是陽極靶式 ( 包括封閉管式和旋轉陽極靶式 ) ,還是同步加速器輻射 X 射線輻射光源 , 都 要求 X 射線源的輻射流密度要盡量大 , 即單位面積的光強大 。 對同一晶體來說 , 只要蛋白質對輻射有一定的耐受力 (否則在收數據的實驗過程中需要更換晶體 ) , X 射線源的強度越高 , 晶體的衍射線強度也就越大 , 衍射線強度越大 , 數據誤差就越小 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 2. X 射線源的選擇 無論是哪種輻射源 , 還 要求射線的發(fā)散度盡量小 , 這又是同步加速器輻射的一大特點 。 它的輻射功率集中于電子軌道平面附近在沿電子前進方向兩側半張角的一毫弧內 , 這個范圍內集中了輻射功率的 85%, 因此, 它可以在幾十米外得到高通量的光源 。 再加上特殊的弧形晶體鏡面的垂直與水平聚焦 , 射線的準直性就更好了 。 陽極靶式 X 光機沒有這個優(yōu)點 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 按 記錄衍射線的方式 可將收集數據的裝臵分為兩大類, 一類是使用對 X 射線敏感的照相底片或圖像板 (image plate ) ;另一類是計數管或面探測器 。 按 記錄裝臵的運動方式 分 , 又有外森堡相機 、 徘循相機 、 回擺相機 、 四圓衍射儀等之分 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 3 衍射線記錄裝臵及其使用方法 X 射線用底片是一個比較好的波松探頭 , 是十幾年前用于記錄X 射線衍射的主要工具之一 , 近年來由于面探測器和圖像板的使用 , 底片已經越來越少見 。 這是 20 世紀 80 年代以前主要用來收集蛋白質數據的方法 。 早期使用的外森堡相機和徘循相機是專門設計成使用 X 射線底片的相機 。 這兩種相機都要使用層線屏將外層衍射線擋住 , 只收取一層內的衍射數據 , 所以效率低 。 目前這兩種相機可能已進入歷史博物館了 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 使用計數管記錄衍射線強度的裝臵主要是四圓衍射儀 。 計數管多為正比計數管或閃爍計數管 , 它將 X 射線光子強度轉換成電信號 , 信號放大后再轉換成數字存入計算機隨時調用 。 四圓中的 3 個圓是調節(jié)晶體方位的 , 另一個圓在水平平面上調節(jié)計數管方位 。 4 個圓配合 , 可在某一特定時刻將某一衍射方向調到與小計數管接收方向一致 。 因此 , 四圓衍射儀是采用逐點收集數據方式的全自動衍射數據收集儀器 , 它的優(yōu)缺點正好和底片相反 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 四圓衍射儀數據精確 , 數據重復誤差只有 2 % 左右 ,但因為是逐點收集 , 所以收集一套數據很費時 , 這對大晶胞晶體收集數據時間之長是難以忍受的 。 同時 ,晶體耐受輻射的時間有限 , 為了收集一套完整的數據就需要多次更換晶體 , 從而引入誤差降低數據的精度。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 面探測器 是由金屬絲構成的面板 , 同樣可以將 X 射線光子強度轉換成電信號 , 因為它呈面板狀 , 所以構成了一組面探測器 ,可同時收集到多個衍射點 , 相當于一張底片 , 從而使它 集計數管記錄數據精確和底片同時收集多點的效率兩者優(yōu)點于一身 ,是不久前實驗室內經常用于一般數據收集的儀器 。 無論四圓衍射儀還是多絲面探側器都可以在程序帶動下完成對一個未知晶體的空間群等初步晶體學參數的鑒定 , 并隨后收集到它的全部衍射強度數據 , 是 自動化很高的數據收集儀 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 近幾年開發(fā)出的 圖像板 又是在面探測器基礎上的一個改進 , 增加了底片那種非常高的距離分辨的優(yōu)點 , 它是集底片和面探測器兩者優(yōu)點于一身的理想的收集數據的方法 , 目前已被廣泛地應用于 X 射線晶體結構分析中 。 記錄裝臵的運動方式中最重要的一種方式為 回擺法 。 回擺相機( 使用底片 ) 、 面探測器和圖像板等都是使用這種運動方式來收集數據的 。 回擺法又稱無層線屏周轉法 , 其特點是同時收集衍射空間的三維數據 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 為了不使衍射斑點重疊 , 必須使晶體每次僅回擺一個很小范圍, 通常是 1176。 ~3176。 角 , 依晶胞大小而定 。 為了給衍射方向指標化 , 使用了部分反射點的信息 , 即一個衍射斑點被分成兩半 ,分別落在相鄰的兩個圖像的相應位臵上 。 利用部分反射點的信息可以計算出晶體方位與機械坐標之間的偏離 ( misorientation ) , 從而可以進一步根據晶胞參數算出衍射線的排布 , 進而對衍射斑點進行掃描并記錄它的強度 。 回擺運動實際上是晶體在測角頭上進行旋轉的運動 , 探測器面板垂于入射線在晶體的后方 , 與晶體的距離可調 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 4 衍射數據收集的全自動化考慮 盡管像圖像板 、 衍射儀這樣的收集數據的裝臵自動化程度已經相當高 , 但為了滿足結構基因組學研究的要求 , 衍射數據收集的全自動化裝臵還有進一步考慮的必要 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 4 衍射數據收集的全自動化考慮 用于結構基因組學研究的晶體量很大 , 它們無一例外地要送到同步加速器輻射實驗室去 。 晶體的收集 、 貯存 、 標識和運輸就是一個大問題 。 晶體到達同步輻射實驗室 , 又需要將晶體安裝到測角頭上并調試到衍射儀上 。 最后還要對晶體衍射質量加以分析 , 考慮數據收集方法等 。 這些步驟目前仍處于手工勞動階段 , 大大影響了實驗進度 , 完全不符合批量生產結構的要求 。幸運的是 , 已經有些實驗室在摸索這方面的全自動化問題 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 X 射線晶體結構分析的核心問題是位相問題 。 位相不能直接由實驗技術探測到 , 因而只能通過一些間接的方法推導出來 。 最基本的方法 , 也是用于一個未知結構的最有效方法是 同晶臵換法 。 在已知結構的基礎上 , 解決不同種屬不同來源的突變蛋白或它的復合物結構還可以使用 分子臵換法和差值電子密度法 。由于同步加速器輻射光源的改進 , 目前多波長的 反常散射法 (MAD ) 已趨成熟 , 大有取代同晶臵換法的可能 , 使解決位相問題大大簡化 , 這對結構基因組學的研究至關重要 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 晶胞的大小和形狀 ( 包括對稱性 ) 決定了晶體的衍射方向;反過來 , 通過衍射點的位臵可以推算出晶胞參數和空間群 , 這叫做 初步晶體學參數的測定 。 但晶胞中的原子種類以及它在晶胞中的分布位臵決定了衍射線強度;反過來 , 通過衍射線強度和一些方法 , 可以了解位相信息 , 從而通過富里衰加和獲得電子密度函數 , 從而獲得原子在晶胞中的分布位臵 , 這就是 晶體結構測定的目的和結果 。 在收集數據后 , 還需對多套數據進行統(tǒng)一 、 還原才可正式用于結構分析 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 1 數據的統(tǒng)一和還原 為了解出一個晶體結構 , 往往需要使用許多晶體收集到該蛋白質的多套數據 , 其中包括母體數據以及一個以上的重原子衍生物的數據 。 這些數據的強度需要校正極化因子和勞倫茲因子 ( LP 校正 ) 、 校正吸收因子 、 校正溫度因子 , 最后再將所有數據統(tǒng)一在一個水平上 , 才可進行下一步的運算 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 2 同晶臵換法 同晶臵換法 是由 Peruz于 20 世紀 50 年代發(fā)現的可以用于解決位相信息的方法 。 當蛋白質晶體中引進了適當的重原子后 , 就造成該晶體衍射線強度的差別 , 從衍射強度的差別就有可能推出位相信息 。 下面按順序介紹重原子衍生物的制備 、 帕特遜分析 、 同晶臵換法的基本原理 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 ( l ) 制備重原子衍生物 使用同晶臵換法測定蛋白質結構 , 原則上需要制備一個以上的同晶重原子衍全物, 同晶重原子衍生物越多 , 越有可能消除位相雙解和實驗誤差 。 如果重原子有較強的反常散射 , 一個重原子衍生物加上反常散射信息也可解決位相的雙解問題。 最近發(fā)展起來的 多波長反常散射 ( MAD ) 法 解晶體結構 , 應該看做是同晶臵換法的特例 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 所謂 重原子衍生物 是指在蛋白質晶體中通過某種方式引入原子序數遠大于碳 、 氮 、 氧的重原子而構成的晶體 。 視蛋白質分子量的大小 , 周期表中原子序數高于碘的元素及其化合物在引入晶體后都有可能提供位相信息 。 這些重原子對 X 射線的散射強 , 有可能改變由碳 、 氮 、 氧組成的蛋白質晶體的 X 射線衍射斑點的強度 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 根據衍射強度的變化 , 首先可以借助于帕特遜分析算出重原子的位臵 , 從而獲得重原子的結構振幅和位相的信息 , 因為根據實驗可以直接測得重原子衍生物和母體的結構振幅 ( 從強度 ), 所以可以建立矢量三角形 ( 圓 ) 來推出母體的位相 。 所引進的重原子必須對晶體沒有大的破壞 , 即不改變原來晶體中蛋白質分子的結構和周期排列 。 與此同時 , 重原子必須在晶胞中占有一個或幾個固定的位臵 , 而且和蛋白質分子有相同的周期排列 。 這種不改變蛋白質周期排布而又在固定位臵引入重原子的方法就叫做 ? 同晶臵換 ? , 這種晶體又稱為同晶臵換重原子衍生物 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 在蛋白質中引進所需要的重原子化合物一般有三種方法:蛋白質經化學修飾后再長晶體 、 共晶生長晶體和晶體浸泡法 。 ① 通過一些化學反應使蛋白質某個基團與重原子化合物發(fā)生化學反應 , 使它們之間形成共價鍵的連接 , 然后進行晶體生長 。這種方法本來很費時費力 , 已不多用 , 但最近由于方法技術的改進又死灰復燃 , 用于多波長散射中很有效 。 ② 將重原子化合物與蛋白質在溶液中混合在一起生長晶體 , 稱為共晶生長 。 這種方法也不很有效 , 已不多用 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 ③ 簡單而又實用的方法就是 浸泡法 , 特別是有了一定經驗之后, 花一段時間 , 總可以找到一些合用的衍生物 。 浸泡法是將蛋白質晶體浸泡到含有重原子化合物的溶液中去 , 溶液中的重原子化合物分子通過擴散接近蛋白質分子 , 通過某種化學反應 (電價絡合 、 共價絡合 ) 或物理因素 ( 空間效應 ) 使重原子化合物固定在蛋白質分子的某一部位 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 在制備重原子衍生物的過程中 , 要不斷對衍生物進行鑒定 , 直到獲得滿意的重原子位臵為止 。 最初是肉眼觀察 , 晶體發(fā)白或產生裂紋是晶體發(fā)生變化的信號 。 最根本的鑒定還是通過 X射線衍射實驗 ,觀察衍射斑點的情況 。 衍生物的最終鑒定還要依靠 帕特遜分析 , 即找到重原子的位臵 , 位臵找不對 , 會得出完全錯誤的結果 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 (2)重原子位臵確定 —— 帕特森 ( Patterson) 分析 這是一個以帕特森名字命名的函數 , 在數學上稱為卷積 , 用它來計算原子間的矢量 。 帕特森分析對位臵少 、 占有率高的重原子可以給出較滿意的結果 , 但對位臵多 、 占有率低的重原子則很難分析 。 如果已經獲得了一個較好的重原子衍生物 , 用它的同晶加上反常散射信息就可計算出一套母體位相 , 然后使用母體位相 , 較差的重原子衍生物與母體的結構振幅之差為系數進行富里哀加和, 這種圖上可以直接顯示重原子位臵 , 應該比帕特森分析簡單而且更靈敏 。 母體位相可通過聯(lián)合概率法來計算 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 3 分子臵換法 如果一個蛋白質分子與另一個已知結構的蛋白質分子近似 , 這種近似粗略地可以從一級結構 ( 蛋白質的氨基酸順序 ) 加以判斷 , 比如說至少有 50% 的近似性 , 就可
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