蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析ppt課件-在線瀏覽
2025-06-22 18:58本頁面
【正文】 tone)的混合物， 它們之間也能相互轉(zhuǎn)化，如圖 。 MetCys鍵也不易裂解。 操作：蛋白質(zhì)先用 5％巰基乙醇在 pH 24h，加色胺 (tryptamine)或色氨酸 (以每分子甲硫氨酸加 5分子色胺或色氨酸計算 )以防止色氨酸氧化。 第三節(jié) 蛋白水解酶酶解 一、 常用蛋白水解酶 (1)胰蛋白酶 (trypsin) 專一作用在 Arg和 Lys(堿性氨基酸 )的羧基端，但對 ArgPro和 LysPro 鍵沒作用。如果樣品溶解度差，可適量加入尿 素增加溶解度，因為胰蛋白酶在 2mol/L尿素中，仍具有充分的活性。 (3)內(nèi)肽酶 LysC(endoproteinase Lysc) 專一作用在 Lys的羧基端。 pH 時，作用在 GluX和 AspX； pH ，僅作用于 Glux 鍵。 (6)凝血酶 (thrombin) 專一裂解在 ArgGly鍵上，在纖維蛋白原工作中，很大程 度上還依賴于鄰近氨基酸序列。 (7)其他 還有專一性較廣的胃蛋白酶 (pepsin)、枯草桿菌蛋白酶 (subtilisin)、木瓜蛋白酶 (papain)、嗜熱菌蛋白酶 (thermolysin)等。應(yīng)采購 TPCK— 胰蛋白酶 (抑制了胰凝乳蛋白酶活 性 )和 TLCK— 胰凝乳蛋白酶 (抑制了胰蛋白 酶活性，才能保 證酶的專一性。l(100181。 l 100mmol/L碘代乙 酸，室溫 15min，加 60181。l [蛋白樣品 :酶 =25:1(質(zhì)量比 )]， 37℃ 保溫 2024h， 凍干樣品或直接注射樣品 (用稀 TFA酸化至約 pH ) 到反相 HPLC柱中分析。精確定量蛋白 質(zhì)是必需的，一般用氨基酸分析來定量微量的蛋白質(zhì)。 g/ml，最少不得低于 100181。l。在標準的 2mol/L尿素， ， SDS含量為 ％ 時，就會影響酶的消化。類 似的，染料考馬斯蘭和兩性電介質(zhì)也會阻止酶的消化。 (3)羧甲基化 Stone等報道，轉(zhuǎn)鐵蛋白用酶解時，羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解很好， 而沒有羧甲基化的轉(zhuǎn)鐵蛋白，酶解程度很差。胰蛋 白酶要用序列級的商品。目前流行的方法是將蛋白質(zhì)電印跡 (blotting)至 PVDF類的膜上，直接進行序列分析或 直接在膜上進行酶解，后者稱為原位分析 (in situ)。膜片再用酶解時的緩沖液漂 洗，然后進行酶解，一般蛋白酶在 100mmol/L NH4HCO3:CAN =95:5， ， 37℃ 酶解過夜，對 V8蛋白酶則在 100mmol/L磷酸 鈉 :ACN=95:5， pH ，室溫過夜。酶解后 20℃ 保存或 立刻用數(shù)微升 10％ TFA酸化，上樣到 HPLC柱上分析。最著名的例 子是核糖核酸酶 (RNase)，它被枯草桿菌蛋白水解酶在 pH ，活性沒有變化，但出現(xiàn)一個新的 N端絲氨酸。 也可用三氯乙酸 (TCA)沉淀法，沉淀部分是 S蛋白，上層 液部分是 S肽。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)中存在著封閉的 N端 有些蛋白質(zhì)的 N端是封閉的，尤其在腹水細胞中， 80％的蛋白質(zhì)的 N 端是乙?；模虼擞?Edman法不能直接測定其序列，要用一系列的化 學(xué)或酶處理。 首先，用溫和的酸處理可以除去甲?；募琢虬彼?(fMet)，也可能 引起絲氨酸、蘇氨酸的乙?；?NO重排反應(yīng)。雖然有乙酰氨基 酸釋放酶 (acylaminoacidreleasing enzyme， AARE)，但它不能作 用長度在 20個氨基酸殘基以上的蛋白質(zhì)或肽。 一、除去蛋白質(zhì)中封閉的 N乙酰絲氨酸和 N乙酰蘇氨酸 樣品置于 ，加無水 TFA，密閉， 40℃ 保溫 1h，然后打開管蓋，讓 TFA揮發(fā)，干燥，再進行序列分析。l ，密閉， 25℃ 水解 24h，打開管蓋，真空除去 HCl，然后進行序列分析。 三、除去 N端的焦谷氨酸殘基 (pyroglutamate) 樣品在序列儀上測不出 N端，則將載有樣品的膜片轉(zhuǎn)移至 烯微量離心管中，用 ％ PVP40洗膜片 (見上節(jié)原位酶解部分 )，再加 100181。g于 50mmol/L磷酸鈉 ，含 10mmol/L DTT)37℃ 酶解 5～ 10h，用水洗膜，干燥，放回序列儀分析。所有含游離氨基或其他堿性基團的肽都結(jié)合至 柱上，僅缺少堿性基團的肽通過柱泄出。 此技術(shù)的局限性是：大肽 (甚至含有堿性基團 )可能不結(jié)合到樹脂上， 因為它們不滲入樹脂孔徑內(nèi)；相反，一些疏水的肽，特別含有色氨酸殘 基，即是它們?nèi)鄙儆坞x的 N端氨基，也可能結(jié)合到柱上。 應(yīng)該指出， N端為谷氨酸的肽在極端 pH下會環(huán)化而轉(zhuǎn)變成封閉，需加 以小心。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)中的 C端殘基的測定 一、羧肽酶法 羧肽酶
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