《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析》ppt課件-預(yù)覽頁
【正文】 一作用在 Arg和 Lys(堿性氨基酸 )的羧基端，但對 ArgPro和 LysPro 鍵沒作用。 (3)內(nèi)肽酶 LysC(endoproteinase Lysc) 專一作用在 Lys的羧基端。 (6)凝血酶 (thrombin) 專一裂解在 ArgGly鍵上，在纖維蛋白原工作中，很大程 度上還依賴于鄰近氨基酸序列。應(yīng)采購 TPCK— 胰蛋白酶 (抑制了胰凝乳蛋白酶活 性 )和 TLCK— 胰凝乳蛋白酶 (抑制了胰蛋白 酶活性，才能保 證酶的專一性。 l 100mmol/L碘代乙 酸，室溫 15min，加 60181。精確定量蛋白 質(zhì)是必需的，一般用氨基酸分析來定量微量的蛋白質(zhì)。l。類 似的，染料考馬斯蘭和兩性電介質(zhì)也會阻止酶的消化。胰蛋 白酶要用序列級的商品。膜片再用酶解時的緩沖液漂 洗，然后進(jìn)行酶解，一般蛋白酶在 100mmol/L NH4HCO3:CAN =95:5， ， 37℃ 酶解過夜，對 V8蛋白酶則在 100mmol/L磷酸 鈉 :ACN=95:5， pH ，室溫過夜。最著名的例 子是核糖核酸酶 (RNase)，它被枯草桿菌蛋白水解酶在 pH ，活性沒有變化，但出現(xiàn)一個新的 N端絲氨酸。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)中存在著封閉的 N端 有些蛋白質(zhì)的 N端是封閉的，尤其在腹水細(xì)胞中， 80％的蛋白質(zhì)的 N 端是乙?；模虼擞?Edman法不能直接測定其序列，要用一系列的化 學(xué)或酶處理。雖然有乙酰氨基 酸釋放酶 (acylaminoacidreleasing enzyme， AARE)，但它不能作 用長度在 20個氨基酸殘基以上的蛋白質(zhì)或肽。l ，密閉， 25℃ 水解 24h，打開管蓋，真空除去 HCl，然后進(jìn)行序列分析。g于 50mmol/L磷酸鈉 ，含 10mmol/L DTT)37℃ 酶解 5～ 10h，用水洗膜，干燥，放回序列儀分析。 此技術(shù)的局限性是：大肽 (甚至含有堿性基團 )可能不結(jié)合到樹脂上， 因為它們不滲入樹脂孔徑內(nèi)；相反，一些疏水的肽，特別含有色氨酸殘 基，即是它們?nèi)鄙儆坞x的 N端氨基，也可能結(jié)合到柱上。 第五節(jié) 蛋白質(zhì)中的 C端殘基的測定 一、羧肽酶法 羧肽酶是最常用的方法，對一些小肽而言， C端有時最容易測定的， 如胰蛋白酶酶解肽段時總是以 Lys或 Arg為 C端； BrCN裂解的肽總是以 高絲氨酸 (homoserlne)為 C端； V8蛋白酶酶解的肽總以 Glu或 Asp為 C 端。對 小肽的 C端序列測定問題不大，但對長肽的序列測定，由于對不同氨基 酸殘基釋放的速度不同，對后面一些氨基酸的序列判斷，可能會出現(xiàn)錯 誤。倒數(shù)第二個氨基 酸殘基影響水解速度，但對這一現(xiàn)象作一歸納或解釋是很困難的。有時加正亮氨酸 (norleucine， 1mol/mol蛋白質(zhì) )為內(nèi)標(biāo)。 (2)羧肽酶 B(CpB) 從蛋白質(zhì) /肽的 C端釋放 Lys和 Arg， CpB存放在－ 20℃ 時，非常穩(wěn) 定。CpY用量一般為底物的 1/50～ 1/100，在 25℃ 作用，于不同時間 取反應(yīng)液酸化后分析游離的氨基酸。而羧肽酶法雖能測到 3～ 5個序列，但這是一個動 態(tài)演繹的方法，有可能錯判。鑒于用同位素在國 內(nèi)不很方便，我們用 4乙烯吡啶標(biāo)記蛋白質(zhì)中的半胱氨酸， 酶解后的肽譜，除用 214nm檢出外，同時還用 254nm檢 出，只有被 4乙烯吡啶修飾的肽在 254nm才有吸收，所以 能方便地檢出。據(jù)此，我們可以 辨別含芳香族氨基酸的肽。 三、含 Lys肽的分離純化和鑒定 賴氨酸的 ε 氨基可以和磷酸吡哆醛 (PLP)形成 Schiff 堿，該衍生物在 325rml有特殊的吸收，利用這一性質(zhì)可找 出含有 Lys殘基的肽段。 用同位素標(biāo)記肽比較麻煩， Shapiro則發(fā)現(xiàn)醛縮酶中 Lys117和磷酸吡哆醛 (PLP)反應(yīng)，并經(jīng) NaBH4還原也可以 形成 Schiff堿，酶活性受抑制，但修飾后的醛縮酶仍可和底 物結(jié)合。 附錄一 微量蛋白質(zhì)實驗室注意事項 (1)環(huán)境 由于是微克級的操作，實驗室內(nèi)的溫度、灰塵、纖維、皮 膚和頭皮屑都會影響結(jié)果。建議用微量透析儀器，或用小的凝膠過濾柱脫鹽， 甚至用揮發(fā)性溶劑，避免脫鹽。蛋白質(zhì) /肽溶在適合的小量溶劑中 (例 5181。 此時，較大的酸性肽可溶在 NH4OH， NH4HCO3，有些蛋白 質(zhì) /肽在此溶劑中不溶解，則可用酸 (70％甲酸，或 TFA)， 并盡快在真空干燥后于 20℃ 保存。必須指出：即使用 Mini Q 水也要新鮮，長期存放的 Mini Q水，在 HPLC空白時，也會 有峰出現(xiàn)。純 化方法見文獻(xiàn) (4)6mol/L鹽酸 濃鹽酸加等體積水，重蒸三次，去除前后餾分。
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