【正文】 合 ） 去計算電子密度圖 。 nm 左右分辨率的圖往往可以正確解出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并給出原子模型 ， 并且可以分析晶體中有序水的結(jié)構(gòu) 。 此外 ， 結(jié)構(gòu)測定中所指的分辨率主要是說明在富里哀加和中所包含的衍射點的數(shù)目 ， 但說明衍射點質(zhì)量的參數(shù)并不多 ， 這一點必須明白 。 還有一種廣泛用于二維圖像和照片的修飾方法稱為 網(wǎng)格圖 （ histogram ） 修飾法 ， 也可用于電子密度圖的修飾 。 ■ 五 、 電子密度圖詮釋 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1. 電子密度修飾 最通常使用的電子密度修飾方法是 溶劑平滑法 （ solvent flattering)， 它基于由誤差擾動產(chǎn)生的蛋白質(zhì) ‘ 溶劑 ’ 區(qū)應(yīng)該到處都一樣的原理 。 電子密度圖是晶體結(jié)構(gòu)分析的直接結(jié)果 ，它包含了結(jié)構(gòu)的全部信急 ， 如何從一套電子密度圖分析出這些信息 ， 尚有一系列問題需要解決 。 目前的軟件還只能使用第一個衍射圖像來評估預(yù)測晶體的幾何形狀等因素 。 現(xiàn)有的程序已經(jīng)相當(dāng)好 ， 自動化程度已相當(dāng)高 ， 使用方便 ， 速度也很決 。 這種重原子衍生物同晶度非常好 ， 而且占有率和占有位可以受壓力的控制 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 雖然占有率不高 ， 但這一弱點恰恰被第三代同步加速器的高能量 、 細(xì)聚焦的優(yōu)點所彌補(bǔ) ， 收集高精度的反常散射數(shù)據(jù)可以使它提供位相信息 。 但反過來 ， 如果蛋白質(zhì)不是由細(xì)菌表達(dá)的 ， 而本身又不含有蛋氨酸 ， 那就會遇到麻煩 。 可喜的是 ， 在過去的 10余年中 ， 已經(jīng)發(fā)展出了一些可以應(yīng)用的方法 。 應(yīng)用這一方法 ， 只需 一個晶體 就可以收集到全部衍射數(shù)據(jù)并解出結(jié)構(gòu) ， 這對結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究的大批量解析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的需求 ， 無疑是一個最重要的方法 。 結(jié)構(gòu)經(jīng)修正后可以精確地顯示酶與底物的結(jié)合 ， 其中包括底物的結(jié)構(gòu)和酶結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化 ， 是一種最簡單的解結(jié)構(gòu)的方法 。 So， 分子臵換法已逐步獲得廣泛的應(yīng)用 ， 是同晶臵換法的一個重要助手 。 對天然蛋白質(zhì)的改造和修飾甚至借助于天然分子骨架構(gòu)建新的蛋白質(zhì) ， 也有望使用這種方法解出結(jié)構(gòu) 。 如果已經(jīng)獲得了一個較好的重原子衍生物 ， 用它的同晶加上反常散射信息就可計算出一套母體位相 ， 然后使用母體位相 ， 較差的重原子衍生物與母體的結(jié)構(gòu)振幅之差為系數(shù)進(jìn)行富里哀加和， 這種圖上可以直接顯示重原子位臵 ， 應(yīng)該比帕特森分析簡單而且更靈敏 。 最根本的鑒定還是通過 X射線衍射實驗 ，觀察衍射斑點的情況 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ③ 簡單而又實用的方法就是 浸泡法 ， 特別是有了一定經(jīng)驗之后， 花一段時間 ， 總可以找到一些合用的衍生物 。 ① 通過一些化學(xué)反應(yīng)使蛋白質(zhì)某個基團(tuán)與重原子化合物發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ， 使它們之間形成共價鍵的連接 ， 然后進(jìn)行晶體生長 。 所引進(jìn)的重原子必須對晶體沒有大的破壞 ， 即不改變原來晶體中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和周期排列 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 所謂 重原子衍生物 是指在蛋白質(zhì)晶體中通過某種方式引入原子序數(shù)遠(yuǎn)大于碳 、 氮 、 氧的重原子而構(gòu)成的晶體 。 下面按順序介紹重原子衍生物的制備 、 帕特遜分析 、 同晶臵換法的基本原理 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 1 數(shù)據(jù)的統(tǒng)一和還原 為了解出一個晶體結(jié)構(gòu) ， 往往需要使用許多晶體收集到該蛋白質(zhì)的多套數(shù)據(jù) ， 其中包括母體數(shù)據(jù)以及一個以上的重原子衍生物的數(shù)據(jù) 。由于同步加速器輻射光源的改進(jìn) ， 目前多波長的 反常散射法 （MAD ） 已趨成熟 ， 大有取代同晶臵換法的可能 ， 使解決位相問題大大簡化 ， 這對結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的研究至關(guān)重要 。 ■ 三 、 衍射數(shù)據(jù)收集 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的核心問題是位相問題 。 晶體到達(dá)同步輻射實驗室 ， 又需要將晶體安裝到測角頭上并調(diào)試到衍射儀上 。 回擺運(yùn)動實際上是晶體在測角頭上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)的運(yùn)動 ， 探測器面板垂于入射線在晶體的后方 ， 與晶體的距離可調(diào) 。 ~3176。 記錄裝臵的運(yùn)動方式中最重要的一種方式為 回擺法 。 同時 ，晶體耐受輻射的時間有限 ， 為了收集一套完整的數(shù)據(jù)就需要多次更換晶體 ， 從而引入誤差降低數(shù)據(jù)的精度。 四圓中的 3 個圓是調(diào)節(jié)晶體方位的 ， 另一個圓在水平平面上調(diào)節(jié)計數(shù)管方位 。 這兩種相機(jī)都要使用層線屏將外層衍射線擋住 ， 只收取一層內(nèi)的衍射數(shù)據(jù) ， 所以效率低 。 按 記錄裝臵的運(yùn)動方式 分 ， 又有外森堡相機(jī) 、 徘循相機(jī) 、 回擺相機(jī) 、 四圓衍射儀等之分 。 它的輻射功率集中于電子軌道平面附近在沿電子前進(jìn)方向兩側(cè)半張角的一毫弧內(nèi) ， 這個范圍內(nèi)集中了輻射功率的 85%， 因此， 它可以在幾十米外得到高通量的光源 。 收集低溫冷凍的晶體不使用毛細(xì)管而是使用特殊的小圓環(huán) ， 將晶體連同母液用這個小圓環(huán)取出來 ， 然后迅速臵于液氮中冷凍 。 這也是為什么蛋白質(zhì)晶體在收集數(shù)據(jù)前要首先密封于一種特殊的毛細(xì)管中的原因 。 所以 ， 層層把關(guān)是必要的 。 還可以使用染料甲基藍(lán)等鑒別 ， 因為蛋白質(zhì)晶體吸收染料的能力極強(qiáng) 。 在低倍光學(xué)顯微鏡下使用針來觸碰微晶 ， 可以感到小分子晶體偏硬 ， 容易碎成兩半或幾瓣；蛋白質(zhì)晶體偏軟 ， 容易碎成粉 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 5 蛋白質(zhì)晶體的鑒定 在某些情況下 ， 在蛋白質(zhì)晶體生長過程中 ， 會長出鹽或某些沉淀劑的晶體 ， 這需要小心加以鑒別 ， 特別是在微晶狀態(tài)下 。 由于鹽濃度不同 ， 造成懸滴和貯液槽之間的水蒸氣壓力的不同 ， 從而發(fā)生水蒸氣的交換 ， 使懸滴中蛋白質(zhì)濃度逐步變濃 ， 從而達(dá)到蛋白質(zhì)緩慢的過飽和 。晶體將從預(yù)先配臵好的過飽和溶液中緩慢生長 。 但是震動問題不易控制 ， 因此失敗的例子也不少 ， 這也說明了防震的重要性 。 ■ 二 、 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 震動因素也是一個需要考慮的重耍問題 。 一般情況下 ， 蛋白質(zhì)皆不能耐受高溫 ， 大多數(shù)蛋白質(zhì)在 60~70℃ 下要變性 ， 有些蛋白質(zhì)只有在低溫下才能保持其活力 。 比如 ， 是配制蛋白質(zhì)的過飽和清液還是使沉淀的蛋白質(zhì)緩慢溶于飽和蛋白質(zhì)溶液中 ？ 比如 ， 蛋白質(zhì)無定形沉淀的回收和再使用 …… 都是值得探討的問題 。 如果這個過程發(fā)展得太快 ， 盡管晶體生長的條件已經(jīng)滿足 ， 蛋白質(zhì)還是完全有可能以 無定 形狀態(tài)或 微晶 從溶液中析出 。 蛋白質(zhì)晶體生長的生化條件主要是指 pH 值 、 離子強(qiáng)度 、 沉淀劑和添加劑 （ 如有機(jī)溶劑 、 鹽或去垢劑 ） 的濃度等因素 。 1 對原材料的要求 ③ 在拿到樣品之后 ， 最好是 做一個等電聚焦 ， 考察一下是否是一條帶 ， 若不是就要小心了 。 構(gòu)成原料的微觀不均一性的某些方面對某些生物化學(xué)研究可能是不重要的 ， 但直接影響到大的單晶的形成 。 ② 晶體生長并經(jīng)冷凍技術(shù)處理； ③ 重原子衍生物制備； ④ 衍射數(shù)據(jù)收集； ⑤ 衍射數(shù)據(jù)分析和改進(jìn)； ⑥ 獲得最后的結(jié)構(gòu)模型 （ 包括修正 ） 。 這樣一來 ， 就可使晶體結(jié)構(gòu)分析的過程大大簡化到猶如操作一臺普通的光學(xué)顯微鏡 ， 甚至達(dá)到使中學(xué)生也可以使用的程度 。該學(xué)科是以生命物質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的運(yùn)動性為基礎(chǔ)來闡明生命活動本質(zhì)的一門學(xué)科 ， 特別是在人體基因組定位之后 ， 又發(fā)展成為 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)或稱結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)學(xué)， 其目的就是獲得全部蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 。 這些復(fù)合物有上百納米的大晶胞 ， 使衍射數(shù)據(jù)量達(dá)到天文數(shù)字 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 科學(xué)的發(fā)展正使人們發(fā)現(xiàn)一些更簡單的方法最終可以直接看到復(fù)雜的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 最后 ， 對 X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的基本原理和光學(xué)顯微鏡的成像原理作一個簡單的類比 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析方法沒有突破以前 ， 培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體當(dāng)然不是個主要問題 。早期的 X光機(jī)功率低 ， 無論是封閉管式還是可拆式 ，X 光能量都很低 。 所謂重原子 ， 就是元素周期表中 碘原子 以上的原子 ， 相對于構(gòu)成蛋白質(zhì)的碳 、 氮 、 氧原子來說它們就是重原子 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 佩魯茨 （ Perutz ） 曾于 1937 年將血紅蛋白的 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析作為他的博士論文 ， 但他完成 血紅蛋白 的 nm 分辨率的晶體結(jié)構(gòu)是 1959 年 ， 這是第二個問世的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu) 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 圖 56 晶體中晶胞和不對稱單位的關(guān)系 。 因為晶胞有對稱性 ， 所以晶胞內(nèi)部由對稱元素相關(guān)的最小單位又稱為 不對稱單位 。 于是， 晶胞的選取只有 7種類型 ， 稱為 7種晶系 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 晶體的最小結(jié)構(gòu)單位叫晶胞 ， 晶體就是通過晶胞在三維空間的周期重復(fù) （ 平移 ） 而構(gòu)成的 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 4 晶體 晶體是衍射光柵 ， 是 X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析的研究對象。 所以 ， 還要介紹富里哀綜合法在測定晶體結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用 。 晶體中分子內(nèi)原子間距在 nm 范圍左右 ， 所以使用波長 nm 左右的 X 射線可以使晶體產(chǎn)生衍射現(xiàn)象 ， 這是因為核外電子散射 X 射線的結(jié)果 。 當(dāng)不考慮衍射線強(qiáng)度時 ， X 射線衍射與可見光的衍射很相似 ， 簡單說來 ， 都是光線通過光柵后改變了光線的傳播方向的一種物理現(xiàn)象 。 它是使用同步加速器的高能物理研究實驗室所提供的寄生輻射 ， 其波長在 nm~1 ?m 之間 （ 從紫外線到 X 射線 ） ， 見圖 520。 這種 X 射線的波長嚴(yán)格和構(gòu)成該材料的原子能級相匹配 。 ☆ 1. X 射線 X 射線是德國物理學(xué)家 倫琴 在 1895 年發(fā)現(xiàn)的 。 所以 ， 從使用的物理工具和研究對象的觀點出發(fā) ， 它包含了 X 射線和晶體這兩方面內(nèi)容 。 X 射線的生成主要有兩種完全不同的方式 ， 一種是陽極靶材料受到高能電子的轟擊 ， 原子的內(nèi)層電子躍遷到外層后又跳回內(nèi)層發(fā)出的所謂 特征 X 射線 。 當(dāng)接近光速的高能帶電粒子在磁場中沿曲線軌道運(yùn)行時 ， 沿切線方向就輻射出電磁波 ， 電磁波的波長和強(qiáng)度與電子能量相關(guān)聯(lián) 。 X 射線衍射是勞厄 （ Laue ） 等人在 1912 年發(fā)現(xiàn)的 。 這是因為散射線的路徑方向不同會產(chǎn)生一個光程差， 從而造成散射線疊加 ， 其后果為 ， 在空間的某處光波加強(qiáng) ， 在另一處則是減弱或相消 。 當(dāng)然 ， 光有布拉格公式還是不夠的 ， 因為它僅僅將光柵結(jié)構(gòu) （ 晶體中晶胞的大小和形狀 ， 包括它的對稱性） 和衍射方向聯(lián)系了起來 ， 至于晶胞中的原子種類及其在晶胞中的分布位臵還要靠衍射線的強(qiáng)度信息才能推導(dǎo)出來 。 晶體中原子的核外電子在空間的分布是周期重復(fù)的， 被稱為 電子密度 。 也就是說 ， 組成晶體的分子 、 原子在三維空間中是嚴(yán)格按著一定次序周期排布的 ， 只有這樣才能形成衍射光柵 。 顯然 ， 僅根據(jù)物質(zhì)在晶體中周期排布這一性質(zhì)來選晶胞是不行的 （ 選取方式太多） ， 所以又增加了一些規(guī)則 ， 如晶胞的三邊盡量成直角等 。 晶胞存在的可能的 230 個空間群 ， 就是利用一定的對稱操作將某物質(zhì)的可重復(fù)部分在 14 種晶體點陣上的安排加以總結(jié)的結(jié)果 。 它們之間的關(guān)系可由圖 56 所示 。 經(jīng)歷了整整 20年 ， 第一張完美的蛋白質(zhì)晶體 ― 胃蛋白酶 的 X 射線衍射照片才出世 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 同晶臵換法 的大意是：要對所研究的蛋白質(zhì)晶體中的分子做一點化學(xué)修飾 ， 即在分子的特定位臵上加入一些 重原子 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 數(shù)據(jù)精度不夠就需要改進(jìn)收集衍射數(shù)據(jù)的儀器設(shè)備 。 另一方面 ， 蛋白質(zhì)晶體學(xué)總是率先使用當(dāng)代運(yùn)轉(zhuǎn)最快速的電子計算機(jī) ， 這是因為它所需要的運(yùn)算量極大 ， 特別是對結(jié)構(gòu)模型的精化 ，沒有大容量 、 速度快的計算機(jī)是不行的 。 所以 蛋白質(zhì)晶體生長技術(shù)也成了蛋白質(zhì)晶體學(xué)發(fā)展的一部分 。 同時 ， 在富里衰加和時又需要解決位相問題 ， 這就使問題復(fù)雜化起來 。 第三代同步輻射的應(yīng)用 ， 使晶體小到20~40nm的蛋白質(zhì)復(fù)合物等結(jié)構(gòu)得以測定并達(dá)到原子分辨率水平 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結(jié)構(gòu)分析 由于 X射線衍射分析技術(shù)的發(fā)展 ， 以及核磁共振 、 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)