【正文】 合 ） 去計算電子密度圖 。 nm 左右分辨率的圖往往可以正確解出蛋白質結構并給出原子模型 ， 并且可以分析晶體中有序水的結構 。 此外 ， 結構測定中所指的分辨率主要是說明在富里哀加和中所包含的衍射點的數目 ， 但說明衍射點質量的參數并不多 ， 這一點必須明白 。 還有一種廣泛用于二維圖像和照片的修飾方法稱為 網格圖 （ histogram ） 修飾法 ， 也可用于電子密度圖的修飾 。 ■ 五 、 電子密度圖詮釋 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 1. 電子密度修飾 最通常使用的電子密度修飾方法是 溶劑平滑法 （ solvent flattering)， 它基于由誤差擾動產生的蛋白質 ‘ 溶劑 ’ 區(qū)應該到處都一樣的原理 。 電子密度圖是晶體結構分析的直接結果 ，它包含了結構的全部信急 ， 如何從一套電子密度圖分析出這些信息 ， 尚有一系列問題需要解決 。 目前的軟件還只能使用第一個衍射圖像來評估預測晶體的幾何形狀等因素 。 現有的程序已經相當好 ， 自動化程度已相當高 ， 使用方便 ， 速度也很決 。 這種重原子衍生物同晶度非常好 ， 而且占有率和占有位可以受壓力的控制 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 雖然占有率不高 ， 但這一弱點恰恰被第三代同步加速器的高能量 、 細聚焦的優(yōu)點所彌補 ， 收集高精度的反常散射數據可以使它提供位相信息 。 但反過來 ， 如果蛋白質不是由細菌表達的 ， 而本身又不含有蛋氨酸 ， 那就會遇到麻煩 。 可喜的是 ， 在過去的 10余年中 ， 已經發(fā)展出了一些可以應用的方法 。 應用這一方法 ， 只需 一個晶體 就可以收集到全部衍射數據并解出結構 ， 這對結構基因組學研究的大批量解析蛋白質晶體結構的需求 ， 無疑是一個最重要的方法 。 結構經修正后可以精確地顯示酶與底物的結合 ， 其中包括底物的結構和酶結合后的結構變化 ， 是一種最簡單的解結構的方法 。 So， 分子臵換法已逐步獲得廣泛的應用 ， 是同晶臵換法的一個重要助手 。 對天然蛋白質的改造和修飾甚至借助于天然分子骨架構建新的蛋白質 ， 也有望使用這種方法解出結構 。 如果已經獲得了一個較好的重原子衍生物 ， 用它的同晶加上反常散射信息就可計算出一套母體位相 ， 然后使用母體位相 ， 較差的重原子衍生物與母體的結構振幅之差為系數進行富里哀加和， 這種圖上可以直接顯示重原子位臵 ， 應該比帕特森分析簡單而且更靈敏 。 最根本的鑒定還是通過 X射線衍射實驗 ，觀察衍射斑點的情況 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 ③ 簡單而又實用的方法就是 浸泡法 ， 特別是有了一定經驗之后， 花一段時間 ， 總可以找到一些合用的衍生物 。 ① 通過一些化學反應使蛋白質某個基團與重原子化合物發(fā)生化學反應 ， 使它們之間形成共價鍵的連接 ， 然后進行晶體生長 。 所引進的重原子必須對晶體沒有大的破壞 ， 即不改變原來晶體中蛋白質分子的結構和周期排列 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 所謂 重原子衍生物 是指在蛋白質晶體中通過某種方式引入原子序數遠大于碳 、 氮 、 氧的重原子而構成的晶體 。 下面按順序介紹重原子衍生物的制備 、 帕特遜分析 、 同晶臵換法的基本原理 。 ■ 四 、 確定位相 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 1 數據的統(tǒng)一和還原 為了解出一個晶體結構 ， 往往需要使用許多晶體收集到該蛋白質的多套數據 ， 其中包括母體數據以及一個以上的重原子衍生物的數據 。由于同步加速器輻射光源的改進 ， 目前多波長的 反常散射法 （MAD ） 已趨成熟 ， 大有取代同晶臵換法的可能 ， 使解決位相問題大大簡化 ， 這對結構基因組學的研究至關重要 。 ■ 三 、 衍射數據收集 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 X 射線晶體結構分析的核心問題是位相問題 。 晶體到達同步輻射實驗室 ， 又需要將晶體安裝到測角頭上并調試到衍射儀上 。 回擺運動實際上是晶體在測角頭上進行旋轉的運動 ， 探測器面板垂于入射線在晶體的后方 ， 與晶體的距離可調 。 ~3176。 記錄裝臵的運動方式中最重要的一種方式為 回擺法 。 同時 ，晶體耐受輻射的時間有限 ， 為了收集一套完整的數據就需要多次更換晶體 ， 從而引入誤差降低數據的精度。 四圓中的 3 個圓是調節(jié)晶體方位的 ， 另一個圓在水平平面上調節(jié)計數管方位 。 這兩種相機都要使用層線屏將外層衍射線擋住 ， 只收取一層內的衍射數據 ， 所以效率低 。 按 記錄裝臵的運動方式 分 ， 又有外森堡相機 、 徘循相機 、 回擺相機 、 四圓衍射儀等之分 。 它的輻射功率集中于電子軌道平面附近在沿電子前進方向兩側半張角的一毫弧內 ， 這個范圍內集中了輻射功率的 85%， 因此， 它可以在幾十米外得到高通量的光源 。 收集低溫冷凍的晶體不使用毛細管而是使用特殊的小圓環(huán) ， 將晶體連同母液用這個小圓環(huán)取出來 ， 然后迅速臵于液氮中冷凍 。 這也是為什么蛋白質晶體在收集數據前要首先密封于一種特殊的毛細管中的原因 。 所以 ， 層層把關是必要的 。 還可以使用染料甲基藍等鑒別 ， 因為蛋白質晶體吸收染料的能力極強 。 在低倍光學顯微鏡下使用針來觸碰微晶 ， 可以感到小分子晶體偏硬 ， 容易碎成兩半或幾瓣；蛋白質晶體偏軟 ， 容易碎成粉 。 ■ 二 、 蛋白質結晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 5 蛋白質晶體的鑒定 在某些情況下 ， 在蛋白質晶體生長過程中 ， 會長出鹽或某些沉淀劑的晶體 ， 這需要小心加以鑒別 ， 特別是在微晶狀態(tài)下 。 由于鹽濃度不同 ， 造成懸滴和貯液槽之間的水蒸氣壓力的不同 ， 從而發(fā)生水蒸氣的交換 ， 使懸滴中蛋白質濃度逐步變濃 ， 從而達到蛋白質緩慢的過飽和 。晶體將從預先配臵好的過飽和溶液中緩慢生長 。 但是震動問題不易控制 ， 因此失敗的例子也不少 ， 這也說明了防震的重要性 。 ■ 二 、 蛋白質結晶和晶體生長 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 震動因素也是一個需要考慮的重耍問題 。 一般情況下 ， 蛋白質皆不能耐受高溫 ， 大多數蛋白質在 60~70℃ 下要變性 ， 有些蛋白質只有在低溫下才能保持其活力 。 比如 ， 是配制蛋白質的過飽和清液還是使沉淀的蛋白質緩慢溶于飽和蛋白質溶液中 ？ 比如 ， 蛋白質無定形沉淀的回收和再使用 …… 都是值得探討的問題 。 如果這個過程發(fā)展得太快 ， 盡管晶體生長的條件已經滿足 ， 蛋白質還是完全有可能以 無定 形狀態(tài)或 微晶 從溶液中析出 。 蛋白質晶體生長的生化條件主要是指 pH 值 、 離子強度 、 沉淀劑和添加劑 （ 如有機溶劑 、 鹽或去垢劑 ） 的濃度等因素 。 1 對原材料的要求 ③ 在拿到樣品之后 ， 最好是 做一個等電聚焦 ， 考察一下是否是一條帶 ， 若不是就要小心了 。 構成原料的微觀不均一性的某些方面對某些生物化學研究可能是不重要的 ， 但直接影響到大的單晶的形成 。 ② 晶體生長并經冷凍技術處理； ③ 重原子衍生物制備； ④ 衍射數據收集； ⑤ 衍射數據分析和改進； ⑥ 獲得最后的結構模型 （ 包括修正 ） 。 這樣一來 ， 就可使晶體結構分析的過程大大簡化到猶如操作一臺普通的光學顯微鏡 ， 甚至達到使中學生也可以使用的程度 。該學科是以生命物質的空間結構的運動性為基礎來闡明生命活動本質的一門學科 ， 特別是在人體基因組定位之后 ， 又發(fā)展成為 結構基因組學或稱結構蛋白質學， 其目的就是獲得全部蛋白質的三維結構與功能的關系 。 這些復合物有上百納米的大晶胞 ， 使衍射數據量達到天文數字 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 科學的發(fā)展正使人們發(fā)現一些更簡單的方法最終可以直接看到復雜的蛋白質三維結構 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 最后 ， 對 X射線晶體結構分析的基本原理和光學顯微鏡的成像原理作一個簡單的類比 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 在蛋白質晶體結構分析方法沒有突破以前 ， 培養(yǎng)蛋白質晶體當然不是個主要問題 。早期的 X光機功率低 ， 無論是封閉管式還是可拆式 ，X 光能量都很低 。 所謂重原子 ， 就是元素周期表中 碘原子 以上的原子 ， 相對于構成蛋白質的碳 、 氮 、 氧原子來說它們就是重原子 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 佩魯茨 （ Perutz ） 曾于 1937 年將血紅蛋白的 X 射線晶體結構分析作為他的博士論文 ， 但他完成 血紅蛋白 的 nm 分辨率的晶體結構是 1959 年 ， 這是第二個問世的蛋白質晶體結構 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 圖 56 晶體中晶胞和不對稱單位的關系 。 因為晶胞有對稱性 ， 所以晶胞內部由對稱元素相關的最小單位又稱為 不對稱單位 。 于是， 晶胞的選取只有 7種類型 ， 稱為 7種晶系 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 晶體的最小結構單位叫晶胞 ， 晶體就是通過晶胞在三維空間的周期重復 （ 平移 ） 而構成的 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 4 晶體 晶體是衍射光柵 ， 是 X 射線晶體結構分析的研究對象。 所以 ， 還要介紹富里哀綜合法在測定晶體結構中的應用 。 晶體中分子內原子間距在 nm 范圍左右 ， 所以使用波長 nm 左右的 X 射線可以使晶體產生衍射現象 ， 這是因為核外電子散射 X 射線的結果 。 當不考慮衍射線強度時 ， X 射線衍射與可見光的衍射很相似 ， 簡單說來 ， 都是光線通過光柵后改變了光線的傳播方向的一種物理現象 。 它是使用同步加速器的高能物理研究實驗室所提供的寄生輻射 ， 其波長在 nm~1 ?m 之間 （ 從紫外線到 X 射線 ） ， 見圖 520。 這種 X 射線的波長嚴格和構成該材料的原子能級相匹配 。 ☆ 1. X 射線 X 射線是德國物理學家 倫琴 在 1895 年發(fā)現的 。 所以 ， 從使用的物理工具和研究對象的觀點出發(fā) ， 它包含了 X 射線和晶體這兩方面內容 。 X 射線的生成主要有兩種完全不同的方式 ， 一種是陽極靶材料受到高能電子的轟擊 ， 原子的內層電子躍遷到外層后又跳回內層發(fā)出的所謂 特征 X 射線 。 當接近光速的高能帶電粒子在磁場中沿曲線軌道運行時 ， 沿切線方向就輻射出電磁波 ， 電磁波的波長和強度與電子能量相關聯(lián) 。 X 射線衍射是勞厄 （ Laue ） 等人在 1912 年發(fā)現的 。 這是因為散射線的路徑方向不同會產生一個光程差， 從而造成散射線疊加 ， 其后果為 ， 在空間的某處光波加強 ， 在另一處則是減弱或相消 。 當然 ， 光有布拉格公式還是不夠的 ， 因為它僅僅將光柵結構 （ 晶體中晶胞的大小和形狀 ， 包括它的對稱性） 和衍射方向聯(lián)系了起來 ， 至于晶胞中的原子種類及其在晶胞中的分布位臵還要靠衍射線的強度信息才能推導出來 。 晶體中原子的核外電子在空間的分布是周期重復的， 被稱為 電子密度 。 也就是說 ， 組成晶體的分子 、 原子在三維空間中是嚴格按著一定次序周期排布的 ， 只有這樣才能形成衍射光柵 。 顯然 ， 僅根據物質在晶體中周期排布這一性質來選晶胞是不行的 （ 選取方式太多） ， 所以又增加了一些規(guī)則 ， 如晶胞的三邊盡量成直角等 。 晶胞存在的可能的 230 個空間群 ， 就是利用一定的對稱操作將某物質的可重復部分在 14 種晶體點陣上的安排加以總結的結果 。 它們之間的關系可由圖 56 所示 。 經歷了整整 20年 ， 第一張完美的蛋白質晶體 ― 胃蛋白酶 的 X 射線衍射照片才出世 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 同晶臵換法 的大意是：要對所研究的蛋白質晶體中的分子做一點化學修飾 ， 即在分子的特定位臵上加入一些 重原子 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 數據精度不夠就需要改進收集衍射數據的儀器設備 。 另一方面 ， 蛋白質晶體學總是率先使用當代運轉最快速的電子計算機 ， 這是因為它所需要的運算量極大 ， 特別是對結構模型的精化 ，沒有大容量 、 速度快的計算機是不行的 。 所以 蛋白質晶體生長技術也成了蛋白質晶體學發(fā)展的一部分 。 同時 ， 在富里衰加和時又需要解決位相問題 ， 這就使問題復雜化起來 。 第三代同步輻射的應用 ， 使晶體小到20~40nm的蛋白質復合物等結構得以測定并達到原子分辨率水平 。 ■ 一 、 概念 —— 基本原理 第一節(jié) X 射線晶體結構分析 由于 X射線衍射分析技術的發(fā)展 ， 以及核磁共振 、 蛋白質結構預