蛋白質(zhì)和氨基酸的測定-資料下載頁
2025-05-01 18:18本頁面
【正文】 為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線 。 6. 說明： 測 蛋白質(zhì)時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品 不用消化。 （四）、 雙縮脲法 1． 原理： 利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán) │ R （ — NH— CH— CO） 對紫外光有吸收作用 ， 在 280 nm下 ， 吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系 ， 求含量 。 （五）、 紫外吸收法 2．適用范圍： 常用于生物化學(xué)工作，因為干擾因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。 3．主要儀器： ① 紫外分光光度計； ② 離心機(jī)： 30005000 r/min 4．操作： 用凱氏法測定標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 第五節(jié) 氨基酸的定性測定 利用各種顯色反應(yīng)： P134138 茚三酮法 吲哚醌法 鄰苯二甲醛法 第六節(jié) 氨基酸定量測定 1. 原理： 氨基酸 本身有堿性 （ NH2） ， 又 有酸性 （ COOH） ，成中性內(nèi)鹽 ， 加入 甲醛溶液 后 ， 與 NH2結(jié)合 ， 堿性消失 ，再用強(qiáng)堿來 滴定 COOH基 。 2． 特點 ： 適用于 發(fā)酵工業(yè) ， 如發(fā)酵液中含氮量 ， 其發(fā)酵過程中氮量減少情況等 。 適于 食品中游離氨基酸的 測定 。 一．氨基酸的 一般定量 測定 （一）甲醛滴定法 3．雙指示劑： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用 氫氧化鈉將 40%甲醛中和至藍(lán)色。 ② %百里酚酞乙醇溶液； ③ %中性紅 50%乙醇溶液； ④ mol/L 氫氧化鈉標(biāo)液。 （一）甲醛滴定法 （一）甲醛滴定法 其它酸性物質(zhì)： + 中性紅指示劑 + NaOH 甲醛滴定法 氨基酸含量： 二者之差 氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)： + 百里酚酞 + 中性甲醛 + NaOH 4. 操 作 （ 二 ） 茚三酮的比色法 原理： 氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng) ，生成藍(lán)紫色化合物 ， 可比色定量 。 二．個別氨基酸的定量測定 8種氨基酸的定量測定方法： P147 一種 微量而快速 的層析方法 ， 它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層 ， 把樣品點在薄層上 ， 然后用合適的溶劑展開 ， 從而達(dá)到分離 、 鑒定和定量的目的 。 因為層析在薄層上進(jìn)行 ， 所以稱為薄層層析 。 它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛 ， 常用來分析氨基酸 、 農(nóng)藥殘留量 、 黃曲霉毒素等 。 第七節(jié) 氨基酸的分離與測定 一 ． 薄層色譜法：薄層層析法 （ TLC 法 ） 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的 Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。 （一）原理 Rf = a/b 樣點 a b 溶劑前沿 點樣原點 （二）優(yōu)、缺點 優(yōu)點 展開時間短，一般在 2030min，展開距離通常只需 10cm，且分離效果好。 層析后得到的斑點小而清晰； 能夠使用多種顯色劑； 點樣量少，靈敏度高，比紙層析高 10100倍，精確到 。 可用于大量分離＞ 500 mg，作為樣品制備層析。 缺點 Rf值重現(xiàn)性比紙上層析差 ? 平鋪法 ? 傾注法 薄層板的制備 展開劑的選擇 點樣 展開 ? 碘蒸汽顯色法 ? 紫外光顯色法 ? 試劑顯色法 顯色 比移值 （三）操作方法： P155 ① 薄層板制備 ② 樣品液制備 ③ 點樣： 距薄板底端 2 cm處，用針畫一標(biāo)記作為原點。再以點樣距扳子寬窄可點幾個點同時展開，點與點之間間隔 1～ 2 cm。 、微量吸管或微量注射器。 注意要等一個點干了再點另一個點。 ф3 mm 濾紙片，浸入樣液，埋到板子上先挖好一個小洞穴。 （三）操作方法 ④ 展開 ：點樣完了 ， 放入密閉容器中 （ 展開槽 ） ， 傾斜一定角度 10～ 30176。 ， 下端浸入展開劑 1 cm， 千萬別讓溶劑浸過了樣點 。 到離頂端一部分 ， 取出樣板 、 晾干 、 顯色 。 ：主要是低沸點的 2～ 3種有機(jī)溶劑組成的溶劑系統(tǒng) ， 分離效果主要決定于展開劑的選擇 ， 因為吸附劑在一定情況下是恒定的 ， 吸附劑的選擇余地遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于展開劑的選擇 。 ： Ⅰ .微量圓環(huán)法 。 Ⅱ .用小載波片試驗 ， 微量展開劑展開 5 cm。 Ⅲ .圖解法： 樣品極性小 ， 選吸附劑活性高 ， 展開劑極性低的 。 樣品極性大 ， 選吸附劑活性低 ， 展開劑極性高 。 有機(jī)溶劑極性由小到大為： 石油醚 、 環(huán)己烷 、 四氯化碳 、 三氯乙烷 、 甲苯 、 苯 、 二氯甲烷 、 氯仿 、 乙醚 、 乙酸乙酯 、 丙酮 、 正丙醇 、 乙醇、 甲醇 、 水 、 吡啶 、 有機(jī)酸類等 。 ⑤ 顯色： ，使斑點顯色，即噴霧顯色。 ，在紫外光下觀察斑點。 。 （涂板時把熒光指示劑加入到固體吸附劑中） 定性： 在同一塊板上 ， 同等條件下操作 ， 被測樣與標(biāo)準(zhǔn)樣同時展開 、 顯色 ， 同 Rf 值或查手冊找相同的 Rf值 。 定量： ：以標(biāo)準(zhǔn)斑點對照 ， 相當(dāng)于樣品斑點中含量ug數(shù) 。 。 ， 定容 ， 離心 ， 比色 。 ： 例：日本島津 CS— 910型雙波長薄層色譜掃描儀 離心薄層色譜儀： 1. LBG— 1型離心薄層色譜儀，北京產(chǎn)； 2. 7924型離心薄層色譜儀，美國 Harrison 公司研制； 3. CLC— 5型離心制備液體色譜儀（日本日立公司，帶紫外檢測器、記錄器和自動收集器，制備量可達(dá) 10 g）。 二 ． 氨基酸自動分析儀法 三 ． 氣相色譜法 四 ． 高效液相色譜法 全自動氨基酸分析儀 103 第十章 重 點 1. 凱氏定氮法原理、分步、測定方法。 2. 雙縮脲法測定原理。 3. 氨基酸總量的測定方法（甲醛滴定法）。 4. TLC法原理、方法， Rf值的作用及計算方法。
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1