第十章蛋白質(zhì)和氨基酸的測(cè)定-資料下載頁(yè)
2025-08-01 13:32本頁(yè)面
【正文】 酸的組分分析 ， 現(xiàn)在廣泛地采用離子交換法 ， 并由自動(dòng)化的儀器來(lái)完成 。其原理是利用各種氨基酸的酸堿性 、 極性和分子量大小不同等性質(zhì) ， 使用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在色譜柱上進(jìn)行分離 。 當(dāng)樣液加入色譜柱頂端后 ， 采用不同的 pH值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來(lái) ， 即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸 ， 其次是非極性的芳香性氨基酸 ， 最后是堿性氨基酸；摩爾質(zhì)量小的比摩爾質(zhì)量大的先被洗脫下來(lái) ， 洗脫下來(lái)的氨基酸可用茚三酮顯色 ， 從而定量各種氨基酸 。 定量測(cè)定的依據(jù)是氨基酸和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物 （ 570nm） 的顏色深淺與各有關(guān)氨基酸的含量成正比 。 但脯氨酸和羥脯氨酸則生成 黃棕色化合物 （ 440nm） ， 故需在另外波長(zhǎng)處定量測(cè)定 。 氨基酸自動(dòng)分析儀 3． 操作方法 ① 樣品處理： 測(cè)定樣品中各種游離氨基酸含量 ， 可以除去脂肪雜質(zhì)后 ， 直接上柱進(jìn)行分析； 測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時(shí)樣品必須經(jīng)酸水解 （ 稱(chēng)取干燥的蛋白質(zhì)樣品數(shù)毫克 ， 加入， 置于 110℃ 烘箱內(nèi)水解 24h， 然后除去過(guò)量的鹽酸 ， 加緩沖溶液稀釋到一定體積 ， 搖勻 ） ， 使蛋白質(zhì)完全變成氨基酸后才能上柱進(jìn)行分析 。 如果樣品中含有糖和淀粉 、 脂肪 、 核酸 、 無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì) ， 必須將樣品預(yù)先除去雜質(zhì)后再進(jìn)行酸水解處理 。 去雜質(zhì)的方法如下： 去糖和淀粉： 把樣品用淀粉酶水解 ， 然后用乙醇溶液洗滌 ， 得蛋白質(zhì)沉淀物 。 去脂肪 ：先把干燥的樣品經(jīng)研碎后用丙酮或乙醚等有機(jī)溶劑離心或過(guò)濾抽提 ， 得蛋白質(zhì)沉淀物 。 去核酸 ：將樣品在 100g/L氯化鈉溶液中 ， 85℃ 加熱 6h， 然后用熱水洗滌 ， 過(guò)濾后將固形物用丙酮干燥即可 。 去無(wú)機(jī)鹽： 樣品經(jīng)水解后含有大量無(wú)機(jī)鹽時(shí)還必須用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行去鹽處理 。 ② 樣品分析：經(jīng)過(guò)處理后的樣品上柱進(jìn)行分析 。 上柱的樣品量根據(jù)所用自動(dòng)分析儀的靈敏度來(lái)確定 。 一般為每種氨基酸 mol左右 （ 水解樣品干重為 ） 。 測(cè)定必須在 pH5～ 、 100℃ 下進(jìn)行 ， 反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間為 10～ 15min， 生成的紫色物質(zhì)在 570nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定 。 而生成的黃色化合物在 440nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定 。 * 顯色反應(yīng)用的茚三酮試劑 ， 隨著時(shí)間推移發(fā)色率會(huì)降低 ， 故在較長(zhǎng)時(shí)間測(cè)樣過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)采用已知濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液上柱測(cè)定以檢驗(yàn)其變化情況 。 * 采用反相色譜原理制造的氨基酸分析儀 ， 可使蛋白質(zhì)水解出的 17種氨基酸在 12min內(nèi)完成分離 ， 且具有靈敏度高 （ 最小檢出量可達(dá) 1pmol） 、 重現(xiàn)性好以及一機(jī)多用等優(yōu)點(diǎn) 。 三、氣相色譜法 1． 原理 將本身沒(méi)有揮發(fā)性的氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于氣相色譜分析的衍生物 —— 三氟乙?；□?。 它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐 （ TFAA） 的?；瘍蓚€(gè)步驟 。 將?；玫陌被嵫苌镞M(jìn)行氣相色譜分析 。 四、高效液相色譜法 高效液相色譜法適于分析沸點(diǎn)高 、 分子量大 、 熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)和生物活性物質(zhì) 。 由于大多數(shù)氨基酸無(wú)紫外吸收及熒光發(fā)射特性 ， 而紫外吸收檢測(cè)器 （ UVD） 和熒光檢測(cè)器 （ FD） 又是 HPLC儀的最常用配置 。 故人們需將氨基酸進(jìn)行衍生化 ， 使其可以利用紫外吸收或熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定 。 氨基酸的衍生可分為柱前衍生和柱后衍生。 柱后衍生需額外的反應(yīng)器和泵， 常用于氨基酸分析儀，如前文所提的茚三酮反應(yīng)。此外， 如熒光胺（ Fluram）、鄰苯二甲醛（ OPA） 也有被人采用。 在氨基酸的 HPLC測(cè)定中，更多的還是采用柱前衍生法 ，這是因?yàn)楸绕鹬笱苌ㄋ膬?yōu)點(diǎn)有：（ 1）固定相采用 C18或其它疏水物，可分辨分子結(jié)構(gòu)細(xì)小的差異；（ 2）反相洗脫，流動(dòng)相為極性溶劑，如甲醇、乙二腈等，避免對(duì)熒光檢測(cè)的干擾，可提高靈敏度及速度；（ 3）一機(jī)多用。 AAs assay by GC 1．原理 將本身 沒(méi)有揮發(fā)性的氨基酸轉(zhuǎn)變 為適合于氣相色譜分析的衍生物 —— 三氟乙酰基氨基酸正丁酯 。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（ TFAA）的 酰 化 兩個(gè) 步 驟 。 將酰 化好的 氨 基酸衍生物 進(jìn) 行 氣 相色 譜 分析。 C CRHNH 2OOH + C H 9 OH4 OONH 3 ClHR CC 4 H9C++ H 2 O+ C H 94C CRHNH 3 ClOO + ( CF 3 CO) O2 C H 94C CRH OONH OC CF 3H C l100、分子量大、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)和生物活性物質(zhì)。 2. 由于大多數(shù)氨基酸無(wú)紫外吸收及熒光發(fā)射特性，而紫外吸收檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器是 HPLC儀的最常的檢測(cè)器。故人們需將 氨基酸進(jìn)行衍生化 ，使其可以利用紫外吸收或熒光檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定。 柱前衍生和柱后衍生 。柱后衍生需額外的反應(yīng)器和泵，常用于 氨基酸自動(dòng)分析儀 ，如前文所提的茚三酮反應(yīng)。 4. 在氨基酸的 HPLC測(cè)定中，更多的還是采用柱前衍生法，這是因?yàn)楸绕鹬笱苌ㄋ膬?yōu)點(diǎn)有：（ 1）固定相采用 C18(反相色譜 )，可分辨分子結(jié)構(gòu)細(xì)小的差異；（ 2）流動(dòng)相為極性溶劑，如甲醇、乙二腈等，避免對(duì)熒光檢測(cè)的干擾，可提高靈敏度及速度；（ 3）一機(jī)多用。 AAs assay by HPLC 蛋白 質(zhì)營(yíng)養(yǎng) 價(jià)的分析方法 氨基酸組成分析 必需氨基酸組成及含量分析 體外酶解分析：蛋白質(zhì)的可消化性能 微生物生長(zhǎng)分析：檢查比需氨基酸及蛋白質(zhì)的質(zhì)量 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法：喂養(yǎng)小鼠。 Protein digestibility= N absorbed / N ingested Actual biological value= N retained/ N absorbed Coefficient of protein= N retained / N ingested THANKS FOR YOUR ATTENTION！
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