第十章蛋白質和氨基酸的測定-預覽頁
【正文】 ， 在國內外應用普遍 。 本章重點： 凱 氏定 氮 法的原理及注意事 項 ， 雙縮脲 法、印三 酮 法及 氨 基酸自 動 分析 儀 的原理及注意事 項 ， 動 物 實驗 法 ，氨基酸總量的測定 。 wash gel in water for at least 1 hour. 2DE 2DE: the technique to separate proteins in the first dimension according to their isoelectric point, by Isoelectric Focusing(IEF), and in the second dimension according to their molecular weight, by SDSPAGE. 2DE bined with protein identification basing on microsequencing, amino acid position and Mass spectrometry, provides an invaluable tool for proteomic studies. Step 1 — Sample Prep Step 2 — FirstDimension (IEF) Separation Step 3 — SecondDimension (SDSPAGE) Separation Step 4 — Protein Detection by Staining /Destaining 凱氏定氮法 凱氏定氮法是先測定總氮量 , 然后乘以蛋白質換算系數(shù)，即可得到粗蛋白質含量。在此主要介紹 常量凱氏定氮法的原理及步驟 。 ① 所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制 。 ⑤ 當樣品消化液不易澄清透明時 ， 可將凱氏燒瓶冷卻 ， 加入 30%過氧化氫 2～ 3mL后再繼續(xù)加熱消化 。 ⑧ 蒸餾裝置不能漏氣 。 (12)混合指示劑 在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。 為了使各種氨基酸呈現(xiàn)不同顏色 ， 可用下列方法： ② 用 ， 10g酚和 90g正丁醇的混合液顯色 。 拍照記錄 ! 2．吲哚醌法 各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色， 因此可借此辯認氨基酸。 說明 在濾紙上顯現(xiàn)氨基酸時，鄰苯二甲醛濃度以 %為宜。 個別氨基酸的顯色反應 利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸可應用于紙層析和紙電泳顯色。 當加入甲醛溶液時 ， NH2基與甲醛結合 ， 從而使其堿性消失 。 再用上述氫氧化鈉標準溶液繼續(xù)滴定至 ， 記錄消耗氫氧化鈉標準溶液毫升數(shù) (V1)。 2． 操作方法 (1)標準曲線繪制 準確吸取相當于 0、 100、 200、 300、 400、 500、 600μ g氨基酸 (單或混合氨基酸 )標準溶液 ， 分別置于 25mL容量瓶或比色管中 ， 各加水補充至容積為 ， 然后加入茚三酮溶液 （ 20g/L） 和磷酸鹽緩沖溶液 （ pH為 ） 各 1mL， 混合均勻 ， 于水浴上加熱 15min， 取出迅速冷至室溫 ， 加水至標線 ， 搖勻 。 3． 結果計算 4． 說明及注意事項 ① 通常采用的樣品處理方法為：準確稱取粉碎樣品 5～ 10g或吸取樣液樣品 5～ 10mL， 置于燒杯中 ， 加入 50mL蒸餾水和 5g左右活性炭 ， 加熱煮沸 ， 過濾 ， 用 30～ 40mL熱 水 (磷酸緩沖液效果如何呢 ?)洗滌活性炭 ， 收集濾液于 100mL容量瓶中 ， 加水至標線 ， 搖勻備測 。 靈敏度較茚三酮法約高 100倍以上，可測到 ～1 10－ 4mol氨基酸。 熒光胺 已有用于氨基酸自動分析定量分析，但由于試劑昂貴及個別氨基酸反應不滿意，目前還未普遍應用。 附 8種氨基酸： 亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、 蛋氨酸、蘇氨酸、 色氨酸、 纈氨酸 第七節(jié) 氨基酸的分離及測定 一、薄層色譜法 1． 原理 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液 ， 滴在制好的薄層板上 ， 在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開 ， 樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附 、 解吸 、 交換等作用 ， 同一物質具有相同的 Rf值 ， 不同成分則有不同的 Rf值 ， 因而各種氨基酸可達到彼此分離的目的 。 當樣液加入色譜柱頂端后 ， 采用不同的 pH值和離子濃度的緩沖溶液即可將它們依次洗脫下來 ， 即先是酸性氨基酸和極性較大的氨基酸 ， 其次是非極性的芳香性氨基酸 ， 最后是堿性氨基酸；摩爾質量小的比摩爾質量大的先被洗脫下來 ， 洗脫下來的氨基酸可用茚三酮顯色 ， 從而定量各種氨基酸 。 如果樣品中含有糖和淀粉 、 脂肪 、 核酸 、 無機鹽等雜質 ， 必須將樣品預先除去雜質后再進行酸水解處理 。 去無機鹽： 樣品經(jīng)水解后含有大量無機鹽時還必須用陽離子交換樹脂進行去鹽處理 。 測定必須在 pH5～ 、 100℃ 下進行 ， 反應進行時間為 10～ 15min， 生成的紫色物質在 570nm波長下進行比色測定 。 三、氣相色譜法 1． 原理 將本身沒有揮發(fā)性的氨基酸轉變?yōu)檫m合于氣相色譜分析的衍生物 —— 三氟乙?；□?。 由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收及熒光發(fā)射特性 ， 而紫外吸收檢測器 （ UVD） 和熒光檢測器 （ FD） 又是 HPLC儀的最常用配置 。此外， 如熒光胺（ Fluram）、鄰苯二甲醛（ OPA） 也有被人采用。 將酰 化好的 氨 基酸衍生物 進 行 氣 相色 譜 分析。 柱前衍生和柱后衍生 。 Protein digestibility= N absorbed / N ingested Actual biological value= N retained/ N absorbed Coefficient of protein= N retained / N ingested THANKS FOR YOUR ATTENTION！
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