【正文】 質(zhì)，可通過逐步提高鹽濃度的方法逐一沉淀分離出來，這種方法稱為分級鹽析。 等電點鹽析沉淀： 鹽析與等電點結(jié)合沉淀效果更好。一般是先將蛋白質(zhì)溶液的 pH調(diào)至目的蛋白質(zhì)的等電點。然后再加固體 (NH4)2SO4或其飽和溶液，使達到一定濃度后，蛋白質(zhì)即可沉淀析出。 有機溶劑沉淀 ： 水溶性有機溶劑如丙酮、乙醇等，具有介電常數(shù)比較小，與水的親和力大，能以任何比例與水相溶等特點。當向蛋白質(zhì)水溶液中加入適量這類溶劑時，它能奪取蛋白質(zhì)顆粒表面的水化膜，同時，還能降低水的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)顆粒間的靜電相互作用，導致蛋白質(zhì)分子聚集絮結(jié)沉淀。 與鹽析法類似，沉淀所需有機溶劑的濃度也與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量有關，相對分子質(zhì)量大的要求濃度低，相對分子質(zhì)量小的要求濃度高。不同相對分子質(zhì)量的混合溶液，可以通過調(diào)節(jié)有機溶劑的濃度達到分級沉淀的目的。 等電點有機溶劑沉淀： 有機密劑沉淀法若與等電點結(jié)合，沉淀更易發(fā)生，而且徹底。先將提取液 pH調(diào)至目的蛋白質(zhì)的等電點、再加有機溶劑到所得要的濃度，蛋白質(zhì)會很快沉淀析出。 注意： 在對蛋白質(zhì)的影響方面，與鹽析法不同。有機溶劑長時間作用于蛋白質(zhì)會引起變性，因此，用這種方法進行操作時需要注意：（ 1）低溫操作。 （ 2）有機溶劑與蛋日質(zhì)接觸時間不能過長，在沉淀完全的前提下，時間越短越好。 失活沉淀： 重金屬鹽沉淀 ：當溶液 pH大于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，易與重金屬離子（ Hg2+、 Pb2+、 Cu2+、 Ag+等）結(jié)合，生成不溶性鹽類，沉淀析出。誤服重金屬鹽的病人，大量口服牛奶、豆?jié){或蛋清能夠解毒，就是因為這些食物中的蛋白質(zhì)與重金屬離子形成不溶性鹽，經(jīng)催吐劑嘔吐排出體外。達到解毒的目的。 生物堿試劑沉淀 ：當溶液的 pH低于等電點時，蛋白質(zhì)分產(chǎn)是陽離子形式存在。易與生物堿試劑（如苦味酸、鞣酸、磷鎢酸、磷鉬酸及三氯醋酸等）作用。生成不溶性鹽沉淀，并伴隨發(fā)生蛋白質(zhì)分子變性。實驗室中常用這些試劑定性檢驗蛋白質(zhì)或去除蛋白。在啤酒生產(chǎn)工藝中借酒花中的單寧類物質(zhì)與蛋白質(zhì)成鹽沉淀，使麥汁得以澄清，防止成品啤酒混濁。 熱凝固沉淀 ：蛋白質(zhì)受熱變性后，將pH調(diào)至等電點，則很容易發(fā)生凝固沉淀。其原因是：由于變性蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)解體，疏水基團外露，水化膜破壞，同時由于等電點破壞了帶電狀態(tài)等而發(fā)生絮結(jié)沉淀。我國傳統(tǒng)的做豆腐工藝是將豆?jié){煮沸，點入少量鹽鹵（含 MgCl2）或石膏（含 CaSO4）， 或者點入酸漿或葡萄糖酸內(nèi)酯將 pH調(diào)至等電點，熱變性的大豆蛋白使很快絮結(jié)凝固，經(jīng)過濾成型則成豆腐。 （ 1） 雙縮脲反應 雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。將尿素加熱到 180℃ ，則兩分子尿素縮合成一分子雙縮脲，并放出一分子氨氣。 雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產(chǎn)生紅紫色絡合物，該反應稱為 雙縮脲反應 。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮腺反應，形成紅紫色絡合物。通?？捎么朔磻ㄐ缘鞍踪|(zhì)，也可根據(jù)反應產(chǎn)生的顏色在 540nm處比色，定量測定蛋白質(zhì)。 （ 2） Millon（ 米倫） ： 反應米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑后立即產(chǎn)生白色沉淀，再加熱后，沉淀變成紅色。酚類化合物有此反應，酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋白質(zhì)都有此反應。 （ 3）黃色反應 ：這是含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反應。蛋白質(zhì)溶液遇硝酸后，先產(chǎn)生白色沉淀，加熱則白色沉淀變成黃色，再加堿，顏色加深成桔黃色。這是因為硝酸將蛋白質(zhì)分子中的苯環(huán)硝化，產(chǎn)生了黃色硝基苯衍生物。例如皮膚、指甲和毛發(fā)等遇濃硝酸會變成黃色。 （ 4）乙醛酸反應 ：在含有蛋白質(zhì)的溶液中加人乙醛酸，并沿試管壁慢慢注人濃硫酸，在兩液層之間會出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質(zhì)有此反應，但不含色氨酸的白明膠就無此反應。 （ 5）茚三酮反應 ：蛋白質(zhì)和氨基酸一樣，也能與水合前三酮反應，生成藍紫色化合物。實踐中常利用這一反應來檢測蛋白質(zhì)的存在。但不能區(qū)別蛋白質(zhì)與氨基酸。 （ 6） Folin（ 福林） 酚試劑反應 ：蛋白質(zhì)分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸中的酚基能將福林 酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。這一反應常用來定量測定蛋白質(zhì)的含量。 （ 7）坂口反應 ： 蛋白質(zhì)分子中的精氨酸含有胍基，能與次氯酸鈉或次溴酸鈉及 a萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色物質(zhì)。此反應用以測定精氨酸或含有精氨酸的蛋白質(zhì)。 一般蛋白質(zhì)在 280nm波長處都都最大的吸收率，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故。通常利用這些特異性的吸收，可以測定蛋白質(zhì)的濃度，如果沒有干擾物質(zhì)存在的話，可用來測定濃度為 ／ ml的蛋白質(zhì)溶液。 返回 蛋白質(zhì)相對分子量的測定 小分子化合物相對分子質(zhì)量的測定方法 冰點降低法、沸點升高法或蒸汽壓減小法 蛋白質(zhì)是大分子膠體物質(zhì)，這些方法不適用。 常用方法有： 化學分析方法 超離心沉降速度法 凝膠過濾層析法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法 超離心沉降速度法 對蛋白質(zhì)溶液進行 5－ 6萬 r/min的高速離心，蛋白質(zhì)分子會向離心池底部方向移動，離心池上面為清液，清液與下面的溶液之間出現(xiàn)一個界面。用光學方法測定界面移動的速度，即為蛋白質(zhì)的 離心沉降速度 。根據(jù)下面的公式可求出溶質(zhì)的 沉降系數(shù) 。 xdtdxS21????x－－ 界面移動距離 ?t－－ 離心時間 ?ω －－ 角速度 ?S－－ 沉降系數(shù) 由沉降系數(shù) S可根據(jù)斯維得貝格（ Sved berg） 方程計算相對分子質(zhì)量。 )1( ?????DR TSM都可以通過實驗求出。、））的密度（－溶劑（一般用緩沖液－擴散系數(shù)比容約為質(zhì)溶于水的偏微分溶液體積的增量，蛋白體積的溶劑中時，即一克溶質(zhì)加到一個大－分子偏微分比體積，－絕對溫度）－氣體常數(shù)（－－??????DSDKTKJRDR T SM33g / c m.g/ )(m ol/)1(????沉降系數(shù) S的意義與應用 沉降系數(shù) S是文獻中經(jīng)常使用的物理量。其物理意義是溶質(zhì)顆粒在單位離心場中的沉降速度，量綱為秒。一個 S單位是l 1013s， 相對分子質(zhì)量越大， S越大。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)大都在 1—200S之間。 當一種新發(fā)現(xiàn)的大分子，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能都處在研究過程中時，其名稱未定，為了描述方便，常用其沉降系數(shù) S來表示。 凝膠過濾法 葡聚糖凝膠過濾法是測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量常用的方法之一，葡聚糖凝膠顆粒有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定。只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外。洗脫時大分了隨洗脫液從顆粒間隙先流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，遲后洗脫下來，所以洗脫體積大。 若用多種已知相對分子質(zhì)量的標準蛋白質(zhì)準確測得各自的洗脫體積（ Ve），以 Ve對相對分子質(zhì)量對數(shù)作圖，得標準曲線，再用同樣條件測定未知樣品洗脫體積（ Ve）， 從標準曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量。凝膠過濾法可測定（ 1—80）萬范圍內(nèi)的相對分子質(zhì)量，誤差為177。 5％。但對變性蛋白和線性分子不適用。 化學分析方法 此法是測定特征性化學成分，計算最低相對分子質(zhì)量。 首先利用化學分析方法則定蛋白質(zhì)中某一持殊成分（某種元素或某種氨基酸）的百分含量。然后，假定蛋白質(zhì)分子中該元素共有一個原子（或一分子某種氨基酸），據(jù)其百分含量可計算出最低相對分子質(zhì)量。 例如，測得細胞色素 c的鐵元素含量為 ％，已知鐵相對原子質(zhì)量為，則最小相對分子質(zhì)量（ M） 為： M＝ 100/≈13000 因為細胞色素 c分子只有一個鐵卟啉輔基，所以，計算結(jié)果與其他方法測得的真實相對分子質(zhì)最相當。 如果蛋白質(zhì)分子中所含已知成分不是一個單位，則真實相對分子質(zhì)量等于最小相對分子質(zhì)量的倍數(shù)。例如，血紅蛋白分了中含鐵 ％，計算出其最低相對分子質(zhì)量為 。只相當于其他方法所得血紅蛋白相對分子質(zhì)量的 1/4?？梢?，血紅蛋白分子中實際含有 4個鐵原子，其真實相對分子質(zhì)量為最小相對分子質(zhì)量的四倍。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法 普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決予荷質(zhì)比。若將蛋白質(zhì)在烷基十二酯硫酸鈉（ SDS） 溶液中于 100℃ 熱處理，并加巰基化合物將二硫鍵打開。則蛋白質(zhì)變性，伸展成棒狀并與 SDS結(jié)合而帶上大量的負電荷，這樣一來，蛋白質(zhì)分子本身的原有電荷就相對地不重要了。所結(jié)合的大量 SDS負電荷決定著分子的帶電性質(zhì)。蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合 SDS多；分子小，結(jié)合 SDS少。因此，不管分子大小，荷質(zhì)比是相同的。 在上述情況下，荷質(zhì)比對不同分子量的 SDS蛋白質(zhì)的電泳遷移率的影響不會有什么差別了。凝膠的分子篩效應對長短不同的棒形分子會產(chǎn)生不同的阻力，這是影響遷移率的主要因素。同一電泳條件下，分子小，受阻小，泳動快，遷移率大。相對分子質(zhì)量大者，遷移率小。 進行 SDS蛋白電泳時，用一種染料（如溴酚藍或甲基綠）作為前沿標志。電泳相對遷移率等于蛋白質(zhì)泳動的距離和原點到前沿距離的比值： 原點到前沿的距離蛋白質(zhì)分子移動的距離??S D SR? μ R與相對分子質(zhì)量的對數(shù)成一定比例關系，測定幾種已知標準相對分子質(zhì)量的 μ R， 并對相對分子質(zhì)量對數(shù)作圖，得一直線。根據(jù)未知相對分 子質(zhì)量的 μ R可從圖上查得相對分子質(zhì)量。這種 方法速度快，樣品用量 少，缺點是誤差大，誤 差來源于遷移距離的測量。 重點復習： 、結(jié)構(gòu)特征、性質(zhì)； 、結(jié)構(gòu)與功能的關系； ； ； 、蛋白質(zhì)分離純化技術的基本原理。 、蛋白質(zhì)的主要鑒別反應。 Hi 下課了！