【正文】 ? 透析 (dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。 ? 超濾法 利用超濾膜在一定壓力下截取一定蛋白質(zhì)的方法。 2．透析與超濾 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 108 3．凝膠過濾 凝膠過濾（ gelfiltration chromatography） 是按照天然蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離的技術(shù)，又稱為分子篩層析或排阻層析。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 109 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 110 （三）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)的分離方法 常用的方法有 ： 離子交換層析 電泳 等電聚焦 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 111 1．離子交換層析 離子交換層析（ ion exchange chromatography） 是利用蛋白質(zhì)兩性解離特性和等電點(diǎn)作為分離依據(jù)的一種方法。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 112 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 113 2. 電泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場中能向正極或負(fù)極移動 。 這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱為 電泳 (elctrophoresis) 。 根據(jù)支撐物的不同 ， 可分為薄膜電泳 、 凝膠電泳等 。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 114 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPAGE)，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。 *等電聚焦電泳 ，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 *雙向凝膠電泳 (2DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 115 SDSPAGE分離蛋白質(zhì)的機(jī)制 (A) SDSPAGE凝膠電泳 （ B）聚丙烯酰胺凝膠的聚合 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 116 SDSPAGE也可測定蛋白質(zhì)分子量 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 117 ? 等電聚焦電泳（ isoelectric focusing electrophoresis,IFE） 是在具有 pH梯度的電場中進(jìn)行的電泳，蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)不同予以分離。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 118 等電聚焦的原理 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 119 ? 雙向電泳（ twodimensional electrophoresis,2DE） 是利用不同蛋白質(zhì)所帶電荷和質(zhì)量的差異，用兩種方法、分兩步進(jìn)行的蛋白質(zhì)電泳。 ? 第一步是以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，在玻璃管中進(jìn)行IEF，使蛋白質(zhì)按其不同的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。 ? 第二步是將 IEF的膠條取出，橫放在另一平板上，進(jìn)行SDSPAGE。 ? 第二次電泳的方向與 IEF垂直，使已按 IEF分離的蛋白質(zhì)再進(jìn)行一次按其不同質(zhì)量再分離。 (2DE) 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 120 雙向電泳的原理及結(jié)果 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 121 三、蛋白質(zhì)含量測定與純度鑒定 （一）蛋白質(zhì)含量測定 1．凱氏定氮法 2． Folin酚試劑法 3．紫外線吸收法 4．考馬斯亮藍(lán)染色法 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 122 （二）蛋白質(zhì)的純度鑒定 ? 蛋白質(zhì)純度常用某一特定成分與總蛋白之比來表示，如每毫克蛋白質(zhì)含多少活性單位 。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 123 四、多肽鏈中氨基酸序列分析 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基 把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析 測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用 Edman降解法 一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 124 Edman降解法測定氨基酸序列 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 125 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 126 通過核酸序列推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 分離編碼蛋白質(zhì)的基因 測定 DNA序列 排列出 mRNA序列 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 127 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 128 五、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測定 ?二級結(jié)構(gòu)測定 通常采用 圓二色光譜 (circular dichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量 。 ?螺旋的 CD峰有 222nm處的負(fù)峰 、 208nm處的負(fù)峰和 198 nm處的正峰三個成分；而 ?折疊的CD譜不很固定 。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 129 ?三級結(jié)構(gòu)測定 X射線衍射法 (Xray diffraction)和核磁共振技術(shù) (nuclear magic resonance, NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法 。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 130 ?用分子力學(xué) 、 分子動力學(xué)的方法 ， 根據(jù)物理化學(xué)的基本原理 ， 從理論上計(jì)算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu) 。 根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其三維空間結(jié)構(gòu) ?通過對已知空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析 ， 找出一級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的關(guān)系 ， 總結(jié)出規(guī)律 ，用于新的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測 。 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 131 Questions ? 組成蛋白質(zhì)的氨基酸有多少種？有何特點(diǎn)？ ? 比較蛋白質(zhì)和氨基酸的理化性質(zhì) . ? 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可分為幾個層次？各指什么？ 維持各級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要化學(xué)鍵是什么？ ? 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系如何？ ? 常用的蛋白質(zhì)的分離純化有哪些？各根據(jù)蛋白質(zhì)的什么性質(zhì)？ 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 132 Special Terms ? 等電點(diǎn) (isoelectric point, pI) ? 肽 (peptide) ? 肽鍵 (peptide bond) ? 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) (primary structure) ? 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) (secondary structure) ? 肽單元 (peptide unit) ? 模體 (motif) ? 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) (tertiary structure) ? 結(jié)構(gòu)域 (domain) ? 蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu) (quaternary structure) ? 蛋白質(zhì)的變性 (denaturation) ? 透析 (dialysis) ? 鹽析 (salt precipitation) ? 電泳 (elctrophoresis) 目 錄 第二章 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 科學(xué)出版社案例式教材《生物化學(xué)》課件 133 The En