【正文】 波、紫外線(xiàn)、 化學(xué)因素：乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、β巰基乙醇、重金屬離子及生物堿試劑等 。 ? 變性的本質(zhì)： —— 破壞 非共價(jià)鍵和二硫鍵 ，不改變蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。 109 ? 應(yīng)用舉例 ?臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消毒及滅菌。重金屬鹽中毒吃大量乳品或蛋清（生）。 ?防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。 ? 蛋白質(zhì)變性后的性質(zhì)改變： 溶解度降低 、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失 及 易受蛋白酶水解 。 110 若蛋白質(zhì)變性程度較輕 ， 去除變性因素后 ， 蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能 ， 稱(chēng)為 復(fù)性 。 不可逆變性 復(fù)性 (renaturation) 111 天然狀態(tài)，有催化活性 尿素、 β巰基乙醇 去除尿素、 β巰基乙醇 非折疊狀態(tài)，無(wú)活性 112 * 蛋白質(zhì)沉淀 維持蛋白質(zhì)膠體系統(tǒng) 穩(wěn)定性的因素被破壞 ， 蛋白質(zhì)就可能產(chǎn)生沉淀 。 113 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì) － － － － － － － － 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì) 水化膜 + + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì) － － － － － － － － 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) 不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 酸 堿 酸 堿 酸 堿 脫水作用 脫水作用 脫水作用 溶液中蛋白質(zhì)的沉淀 114 ? 引起蛋白質(zhì)沉淀的因素： ? 加高濃度鹽類(lèi) 硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等 ? 加有機(jī)溶劑 酒精、丙酮等 ? 加重金屬鹽 氯化高汞、硝酸銀、硝酸鉛 及三氯化鐵等 ? 加某些酸類(lèi) 苦味酸、單寧酸、三氯乙酸 等能和蛋白質(zhì)化合成不溶解的蛋白質(zhì)鹽而沉淀。 ? 變性與沉淀的關(guān)系： ? 變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。 115 ? * 蛋白質(zhì)的凝固作用 (protein coagulation) ? 蛋白質(zhì)經(jīng)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿作用變性后，仍能溶解于強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液中，若將 pH調(diào)至 pI，則變性蛋白質(zhì)立即結(jié)成絮狀的不溶解物，此絮狀物仍可溶解于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。如再加熱則絮狀物可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中，這種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的凝固作用。 116 （四）蛋白質(zhì)的紫外吸收 由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的 酪氨酸 和 色氨酸 ， 因此在 280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰 。 蛋白質(zhì)的 OD280與其濃度呈正比關(guān)系 ， 因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定 。 117 （五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng) ⒈ 茚三酮反應(yīng) (ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的 氨基酸 也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。生成藍(lán)紫色化合物 ⒉ 雙縮脲反應(yīng) (biuret reaction) 蛋白質(zhì)和多肽分子中 肽鍵 在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。 118 二、蛋白質(zhì)的分離和純化 （一）透析及超濾法 * 透析 (dialysis)： 利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。將蛋白溶液裝入用半透膜制成的透析袋中，可將蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物除去，這種方法叫透析。 如在袋外放吸水劑（如聚乙二醇）還可達(dá)到濃縮的目的。 應(yīng)用：除鹽和濃縮 119 120 ? 超濾法 ：應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。 ? 超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。 121 （二）丙酮沉淀、鹽析 *使用 丙酮沉淀 時(shí) ， 必須在 0～ 4℃ 低溫下進(jìn)行 ，丙酮用量一般 10倍于蛋白質(zhì)溶液體積 。 蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后 ， 應(yīng)立即分離 。 除了丙酮以外 ， 也可用乙醇沉淀 。 *鹽析 (salt precipitation)是將硫酸銨 、 硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液 ， 使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞 ， 導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀 。 122 （三）電泳 蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆粒 ， 在電場(chǎng)中能向正極或負(fù)極移動(dòng) 。 這種通過(guò)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù) , 稱(chēng)為 電泳 (elctrophoresis) 。 由于不同的蛋白質(zhì)帶電多少 、 分子量大小及分子形狀不同 ， 因此在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度就不同 ， 從而可將蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái) 。 123 根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 *SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 ：常用于蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定。 *等電聚焦電泳 ：通過(guò)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。 *雙向凝膠電泳： 是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。 124 （四）層析 層析 (chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理 待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的 。 125 蛋白質(zhì)分離常用的層析方法 * 離子交換層析： 利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。 * 凝膠過(guò)濾 (gel filtration)又稱(chēng)分子篩層析： 利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。 126 127 128 （五）超速離心 ?超速離心法 (ultracentrifugation) 不同蛋白質(zhì)的密度與形態(tài)各不相同 ， 在離心力場(chǎng)中沉降的速度也不同 ， 從而將其分離 。 ?既可以用來(lái)分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量 。 *蛋白質(zhì)在離心場(chǎng)中的行為用 沉降系數(shù)(sedimentation coefficient, S)表示 ,沉降系數(shù)與蛋白質(zhì)的密度和形狀相關(guān) 。 129 ?S大體上與蛋白質(zhì)分子量呈正比關(guān)系。 ?S與蛋白質(zhì)的密度和形狀有關(guān)。 ?如分子量相同，緊密顆粒的摩擦系數(shù)小 —— 沉降快；而疏松顆粒的摩擦系數(shù)大； —— 沉降慢。 ?應(yīng)用：蛋白質(zhì)的分離純化和測(cè)分子量。 130 復(fù)習(xí)題 ? 名詞解釋 ? 肽單元、一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu) ? 蛋白質(zhì)的基本組成單位是什么？有多少種？按側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)和功能不同，可分為幾類(lèi)？各包括哪些氨基酸？ ? 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有幾種？各有何特征，由什么化學(xué)鍵維持？ 131 ? 什么是蛋白質(zhì)變性？變性因素有哪些？變性本質(zhì)是什么？變形后有什么改變？ ? 何為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)？當(dāng) pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)帶何種電荷？當(dāng) pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)帶何種電荷？ ? 蛋白質(zhì)分離純化有幾種方法？根據(jù)是什么？ ? 維持蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵有哪些？哪種最重要？ 132 三、多肽鏈中氨基酸序列分析 1. 分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成 2. 測(cè)定多肽鏈的 N端與 C端的氨基酸殘基 3. 把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析 4. 測(cè)定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法 5. 經(jīng)過(guò)組合排列對(duì)比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。 （一）改進(jìn)的 Sanger法 133 水解肽鏈的方法及特征 裂解劑 裂解位點(diǎn) 胰蛋白酶 Lys、 Arg（ C） 胰凝乳蛋白酶 Phe、 Tyr、 Trp（ C） 彈性蛋白酶 Ala、 Gly、 Ser、 Val（ C） 胃蛋白酶 Phe、 Trp、 Tyr（ N） 溴化氰 Met（ C） 羥胺 Asn— Gly 134 通過(guò)核酸推演的方法 按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列 分離編碼蛋白質(zhì)的基因 測(cè)定 DNA序列 排列出 mRNA序列