【正文】 2022年 8月 140 ? 研究人員在建立方法的早期，一般會按照臨床建議的最大人用劑量確定一個非正式的限值，這個限值可以根據(jù)實驗室可以達到的最低檢測水平，把限值訂的相對比較嚴格，但往往由于早期的臨床劑量會比最終上市的臨床劑量高幾倍，所以嚴格的限值，可能會使得正式投產(chǎn)時很多產(chǎn)品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費。 2022年 8月 141 ? 相反也可以按照法規(guī)允許的最高水平，確定樣品的限值，但是若標準制訂的太接近法規(guī)允許的計算值，一旦產(chǎn)品內(nèi)毒素水平超出允許范圍，幾乎沒有警告和改善生產(chǎn)條件的機會，并失去日常檢驗對生產(chǎn)過程的質(zhì)量監(jiān)督作用。 ? 若標準制訂的離法規(guī)允許的計算值較遠，通過日常檢測結果可以掌握內(nèi)毒素含量的變化，從而為改善生產(chǎn)環(huán)境提供充足的時間。 2022年 8月 142 ? 樣品內(nèi)毒素限值的確定一般與臨床人體最大給藥劑量有關，劑量越大，單位重量或體積的內(nèi)毒素限值越低。 ? 一般按以下公式確定： 內(nèi)毒素限值 =K/M ? 式中內(nèi)毒素限值是以 EU/ml， EU/mg或EU/u表示； K為按規(guī)定的給藥途徑，人體每公斤體重每小時最大可耐受的內(nèi)毒素劑量，以 EU/（ ）表示。注射劑K=5EU/（ ），其中放射性藥品注射劑 K=（ ），鞘內(nèi)用注射劑K=（ ）。 2022年 8月 143 ? 假如我國人群平均體重按 60kg計算，人體對細菌內(nèi)毒素的最大耐受量為 300EU/h，假如我國人體的平均體表面積按 計算，人體每平方米的最大耐受劑量為(300 EU/h)/ = （ 193EU/h ） / m2 。 M為人體每公斤體重每小時接受的最大給藥劑量，以 ml/（ ）、 mg/（ ）或 u/（ ）表示。 2022年 8月 144 ? 內(nèi)毒素限值計算舉例（一）： ? A產(chǎn)品的人體最大用量為每小時 ，每公斤每小時體重的劑量為? 內(nèi)毒素限值 =K/M=(5EU/kg)/( 25 )mg/kg = ? 因為在細菌內(nèi)毒素檢查法中，細菌內(nèi)毒素標準品和鱟試劑均以 EU/ml表示，所以在具體實驗中樣品的內(nèi)毒素的限量可以轉(zhuǎn)換為 EU/ml的表示方法，可使實驗操作計算更為方便。假定產(chǎn)品 A的濃度為 100mg/ml，或原料藥經(jīng)溶解后的濃度為 100mg/ml, 那么，將產(chǎn)品 A的限值從EU/mg轉(zhuǎn)變?yōu)?EU/ml時，內(nèi)毒素限值 = EU/mg ? 100 mg/ml = 20 EU/ml 2022年 8月 145 ? 內(nèi)毒素限值計算舉例（二）： ? B產(chǎn)品的劑量為 1g/m2，規(guī)格為 50mg/ml， ? 內(nèi)毒素限值 =（ 193 EU/ m2） /1g/m2=193 EU/g= EU/mg ? 轉(zhuǎn)變?yōu)?EU/ml= EU/mg? 50 mg/ml = EU/ml 2022年 8月 146 ? 大輸液品種的限值一般定為 ，滅菌注射用水則定為 。 ? 內(nèi)毒素限值沒有考慮到幾個藥物聯(lián)合用藥問題，但一般情況下，藥品中內(nèi)毒素的含量遠低于限值，并且藥品生產(chǎn)廠家的內(nèi)控標準嚴于法規(guī)標準，所以藥典內(nèi)毒素限值也被稱為最大允許內(nèi)毒素濃度（ Maximum allowable endotoxin concentration）。 2022年 8月 147 2 樣品溶解度的考察試驗 ? 如果不清楚樣品的溶解度特性，即使有了樣品的內(nèi)毒素限值，也不可能進行預試驗，所以，必須先考察樣品的溶解度。對于水不溶解樣品可以考慮先溶解在合適（不破壞內(nèi)毒素）的溶劑中，然后溶解在水或緩沖液中，同時確定能夠使樣品溶解的最佳比例和足以克服干擾的水溶液中的稀釋倍數(shù)。 2022年 8月 148 ? 樣品溶液的 pH值往往和溶解度相關，常需要調(diào)節(jié)溶液的酸堿性，以促進溶解。需要提起注意的是如果對樣品進行了處理，同樣對添加了標準內(nèi)毒素的樣品陽性對照也要進行同樣的處理，以證明處理樣品的手段沒有破壞任何可能存在的內(nèi)源性內(nèi)毒素。 2022年 8月 149 3 最大有效稀釋倍數(shù)或最小有效濃度的計算 ? 最大有效稀釋倍數(shù) (MVD)是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，對產(chǎn)品進行最大倍數(shù)的稀釋，仍能夠進行內(nèi)毒素限值的檢測。 ? 計算 MVD的一般公式為： ? 當被規(guī)定的內(nèi)毒素的限值以體積表示時， ? MVD=（內(nèi)毒素限值 EU/ml ） /鱟試劑靈敏度（ λ） 2022年 8月 150 ? 當內(nèi)毒素的限值以重量或藥品的生物活性 (EU/mg或 EU/U)表示時， MVD=（內(nèi)毒素限值 EU/mg 或 EU/U ） 供試品溶液的濃度） / 鱟試劑靈敏度 (λ) ? 在凝膠技術中 , λ=鱟試劑的標示靈敏度（ EU/ml），或是在濁度法或顯色法中 , λ=所使用標準曲線上最低點的濃度（ EU/ml）。 2022年 8月 151 ? 最小有效濃度（ MVC）是指在所選擇的鱟試劑靈敏度條件下，將產(chǎn)品稀釋到最小濃度，仍能夠進行內(nèi)毒素限值的檢測。 ? 計算 MVC的一般公式為： ? MVC=鱟試劑靈敏度（ λ） /內(nèi)毒素限值 ? 對所選定的鱟試劑靈敏度 MVC是一個絕對值，而 MVD對特定的產(chǎn)品濃度是特異的，濃度變化時， MVD也會隨之發(fā)生變化。 2022年 8月 152 4 預試驗 ? 確定了樣品的內(nèi)毒素限值，考察了樣品的溶解度，并且選定了一定靈敏度的鱟試劑，此時便可以考慮進行預試驗。盡管法規(guī)中并不要求進行預試驗，但在細菌內(nèi)毒素檢查法的建立過程中，一般要進行預試驗。預試驗的主要目的是確定不出現(xiàn)干擾的第一個樣品稀釋度，也就是不干擾濃度（ noninterfering concentration, NIC） ,從而為后續(xù)的驗證實驗選擇適當?shù)臉悠废♂尪龋ɑ驖舛龋? 2022年 8月 153 ? 首先，要檢查樣品的 pH值是否在適當?shù)姆秶鷥?nèi)， 2022版藥典中規(guī)定 pH為 。如果超出了適宜的范圍時，可用無內(nèi)毒素的 NaOH或 HCL溶液調(diào)節(jié) pH。 ? 不管采用凝膠法還是光度法，都是對一系列樣品的稀釋液進行試驗。 2022年 8月 154 ? 在每一個稀釋濃度，都有一添加內(nèi)毒素樣品和一個不添加內(nèi)毒素的樣品，添加內(nèi)毒素的濃度保持不變，而樣品濃度會逐級稀釋，但最終樣品的稀釋倍數(shù)不得超過 MVD。可以直接把內(nèi)毒素添加到樣品溶液中，添加內(nèi)毒素的體積宜小，以免導致樣品溶液被稀釋。一般添加體積等于或小于樣品體積的 10%為宜。也可以采用下述方法添加內(nèi)毒素，就是將兩倍于終濃度的內(nèi)毒素溶液與兩倍于終濃度的樣品溶液等體積混合，內(nèi)毒素和樣品溶液間相互稀釋，得到兩者所需終濃度的混合液。 2022年 8月 155 ? 添加內(nèi)毒素的濃度，凝膠法為 2λ（ 2?標示靈敏度），終點比色法為 4λ，這里的 λ表示標準曲線上的最低點，也就是方法的檢測限。動態(tài)比色法則有 3種選擇添加內(nèi)毒素濃度的方法?？梢赃x擇標準曲線的中點濃度；也可以與終點比色法一樣，選擇 4λ；此外，當樣品稀釋液中，內(nèi)毒素的限值小于或等于 ，添加內(nèi)毒素的濃度可定為 ，當樣品稀釋液中，內(nèi)毒素的限值大于或等于 時，添加內(nèi)毒素的濃度可定為 間。 2022年 8月 156 ? 對于凝膠法的結果判斷，不添加內(nèi)毒素的樣品不應該凝集，如果發(fā)生凝集說明含有內(nèi)毒素或內(nèi)毒素樣物質(zhì)，添加有內(nèi)毒素的樣品應該出現(xiàn)凝集，若沒有發(fā)生凝集表明樣品凝集反應被抑制。光度法的結果判斷標準為，測得的添加內(nèi)毒素的量應該在已知添加量的 177。 50%范圍內(nèi)，超出范圍（多或少）表明存在增強或抑制作用。 2022年 8月 157 ? 通過預試驗的結果可以確定驗證試驗中樣品的稀釋度或濃度，其選擇的基本原則包括：經(jīng)稀釋后的樣品含內(nèi)毒素的量應盡可能少，比其內(nèi)毒素限值至少少 4倍，最好檢測不到內(nèi)毒素。 要求驗證試驗選擇的稀釋度至少要比 NIC大 12倍 ，同時，不可超過 MVD。 2022年 8月 158 ? 若樣品需要多支合并進行驗證試驗，此時試驗不可采用原來的 MVD。因為假定合并樣品中有一瓶存在污染，其它瓶沒有污染，污染瓶含有的內(nèi)毒素就會被其它沒有污染瓶樣品所稀釋，并低于 MVD，從而檢測不到污染的樣品，因此，采用合并樣品進行試驗時， MVD應降低，這種情況下的 MVD等于原來的 MVD除以合并樣品的數(shù)量。 2022年 8月 159 ? 例如：假定鱟試劑的標示靈敏度 λ為 ，樣品的 MVD為 1： 100。 ? 標示靈敏度復核試驗： 細菌內(nèi)毒素標準品濃度（ EU/ml） 陰性對照 標準品 鱟試劑 + + 鱟試劑 + + 鱟試劑 + + 鱟試劑 + + 2022年 8月 160 ? 預試驗結果 ? 結果表明樣品在 1： 8倍稀釋時，具有抑制作用， ? 不干擾濃度（ NIC）為 1:16，可選擇用于驗證試驗的稀釋度或濃度為最低不小于 1:32，可以選擇 1:64。 原液 1： 2 1： 4 1： 8 1： 16 1： 32 1： 64 1： 128 鱟試劑 鱟試劑 內(nèi)毒素 +鱟試劑 + + + + 內(nèi)毒素 +鱟試劑 + + + + 2022年 8月 161 5 驗證試驗（增強 /抑制試驗） ? 驗證試驗在細菌內(nèi)毒素方法學的建立過程中具有十分重要的作用，主要目的是確證檢測內(nèi)毒素的方法學不受樣品的干擾。驗證試驗的特點是樣品濃度保持不變，添加內(nèi)毒素的濃度則逐漸降低。在建立細菌內(nèi)毒素檢查方法中，驗證試驗前，要去除樣品可能含有的內(nèi)毒素，以確保建立方法的準確可靠。一般情況下要求用于驗證試驗的這批樣品，含內(nèi)毒素的量明顯低于內(nèi)毒素限值（至少低于 4倍），檢測不到內(nèi)毒素最為理想。 2022年 8月 162 ? 凝膠法的驗證試驗通過在水和樣品溶液中平行進行鱟試劑標示靈敏度的復核試驗完成，試驗中要求樣品平行 4管，設立樣品陰性對照管，也同樣平行 4管。盡管要求添加內(nèi)毒素標準平行管數(shù)量各國不完全一致，可以 2管，也可以 4管，但鑒于目前國內(nèi)的具體情況，在 2022版藥典附錄的細菌內(nèi)毒素檢查法中規(guī)定是平行 4管。 2022年 8月 163 ? 水和樣品溶液中的反應終點濃度的對數(shù)平均值（內(nèi)毒素含量）必須在鱟試劑標示靈敏度的 2倍范圍以內(nèi)，在樣品溶液和水中的反應終點濃度的對數(shù)平均值也應相互在 2倍范圍之內(nèi)（ 2λ~）。 2022年 8月 164 ? 若樣品需要多支合并進行驗證試驗，此時試驗不可采用原來的 MVD。因為假定合并樣品中有一瓶存在污染，其它瓶沒有污染，污染瓶含有的內(nèi)毒素就會被其它沒有污染瓶樣品所稀釋，并低于 MVD，從而檢測不到污染的樣品，因此，采用合并樣品進行試驗時， MVD應降低，這種情況下的 MVD等于原來的 MVD除以合并樣品的數(shù)量。 2022年 8月 165 ? 光度法的驗證試驗中，要求陰性對照所含有的內(nèi)毒素必須明顯低于標準內(nèi)毒素曲線中的最小濃度，陽性對照的內(nèi)毒素回收率，在扣除樣品可能含有的內(nèi)源性內(nèi)毒素后，必須在已知添加內(nèi)毒素量的50~200%之間。添加和未添加內(nèi)毒素的樣品管數(shù)量至少要平行 2管。 2022年 8月 166 ? 驗證試驗必須采用 3批樣品進行試驗，對每批樣品的數(shù)量沒有具體要求，一般每批最少分別選擇生產(chǎn)過程開始、中期和末期的 3瓶樣品，并且 3瓶樣品可以合并后用于試驗。 2022年 8月 167 6 樣品日常檢測 ? 對所有的樣品進行日常檢測時，樣品及各種對照一定要至少平行 2管，在所有的實驗中必須包括陰性對照和陽性對照。 2022年 8月 168 四、常見的干擾因素和處理 ? 細菌內(nèi)毒素檢查法是一種基于鱟試劑中的酶蛋白在模擬的生理環(huán)境下進行的反應，在反應過程中會受到很多生化因素的影響。此外，由于內(nèi)毒素本身的特性決定了容易被吸附和集聚。所以，細菌內(nèi)毒素檢查試驗經(jīng)常存在干擾問題也就很容易理解。 2022年 8月 169 ? 經(jīng)常遇到的干擾因素可歸納成 5個主要方面，包括： ? 不適宜的 pH條件 ? 添加對照內(nèi)毒素的集聚或吸附 ? 不適當?shù)年栯x子濃度 ? 酶或蛋白的修飾 ? 非特異的鱟試劑激活 2022年 8月 170 1 不適宜的 pH條件 ? 鱟試劑引起凝集本身就是一種生理系統(tǒng)產(chǎn)物，很多藥物可以引起這種生理反應系統(tǒng) pH的變化，從而影響凝集反應。這也是細菌內(nèi)毒素檢查法中最常見和最重要的影響因素。正是考慮到上述 pH的影響，很多鱟試劑生產(chǎn)廠家在凍干或復溶時使鱟試劑具有了緩沖能力，在一定程度上可以緩沖 pH的變化。另外也可以采用調(diào)節(jié) PH的方式，首先用 HCL或NaOH溶液對樣品進行 pH的調(diào)整，使之調(diào)整到合適的范圍。對于酸性或堿性更強的樣品，開始可用更強的緩沖液進行調(diào)整。 2022年 8月 1